馬征兵，閔保華，張永奇 ，羅亞寧

（1.河南省安陽市婦幼保健院生殖科,河南安陽 455000；2.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,陜西西安 710038）

既往筆者探討了多種精子優(yōu)化法可選擇應(yīng)用于夫精宮腔內(nèi)人工授精術(shù)前精液的體外處理，其中洗滌上游法適用于精液常規(guī)檢查大致正常者[1]。近來筆者采用了一種新的精子優(yōu)化法，即不離心直接上游法，實(shí)踐表明，該法同洗滌上游法一樣，可成功用于夫精宮腔內(nèi)人工授精前精液的體外處理，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

收集的數(shù)據(jù)來自安陽市婦幼保健院生殖科和第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心于2009年7月～2009年12月擬行夫精宮腔內(nèi)人工授精丈夫精液體外處理前后的實(shí)驗(yàn)記錄，丈夫精液常規(guī)檢查大致正常者90例共130個(gè)周期。采用2種上游法按照隨機(jī)原則對這90例不孕不育患者共130個(gè)周期進(jìn)行精液體外優(yōu)化，其中洗滌上游法70個(gè)周期，不離心直接上游法60個(gè)周期。標(biāo)本采集時(shí)囑丈夫禁欲3～7 d，于授精日手淫將精液完整取于一次性無毒無菌取精杯內(nèi)，放無菌超凈工作臺內(nèi)室溫下直到精液完全液化后備用。

1.2 儀器與試劑

CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），超凈工作臺（蘇州蘇凈公司），WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng) （北京偉力公司）；Diff-Quik快速染色試劑盒（廣東友寧公司），Q-HTF精子洗滌和培養(yǎng)液（美國ZDL公司），G-IVFTM-plus精子處理和受精液（瑞典Vitrolife公司）。

1.3 精子動(dòng)態(tài)與形態(tài)學(xué)檢查

精子優(yōu)化前，將已液化的精液按WHO實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液常規(guī)分析[2]；精子動(dòng)態(tài)學(xué)主要參數(shù)（密度、活率、活力分級）采用WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)軟件進(jìn)行計(jì)算；精子形態(tài)學(xué)主要參數(shù)（正常形態(tài)精子百分率）采用人工計(jì)數(shù)方法計(jì)算。檢查時(shí)，取0.5 ml精液加0.5 ml生理鹽水充分混勻，用巴士德吸管吸取這1 ml稀釋的精液滴片、拉薄技術(shù)制片2張，按照WHO推薦的Diff-Quik法進(jìn)行染色；在光學(xué)顯微鏡油鏡（×1 000）下，每張片至少讀取200個(gè)精子，用嚴(yán)格判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判別；人工計(jì)數(shù)正常形態(tài)及畸形精子數(shù)，最后取2張片子結(jié)果的均數(shù)。

1.4 精子優(yōu)化方法

洗滌上游法：向已液化的精液內(nèi)加入等體積經(jīng)37℃、5%CO2平衡過的Q-HTF精子洗液，充分混勻后400×g離心10 min，留管底精子沉淀加3 ml Q-HTF精子洗液再次混勻，300×g離心6 min，去除上清液后，向底部沉淀精子上方緩慢加入1.5 ml G-IVFTM-plus液，傾斜 45°置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育40 min后，用無菌巴士德吸管吸取G-IVFTM-plus上層云霧狀含精子的懸液1.0 ml，置于無菌小試管內(nèi)，用可調(diào)移液器吸取5.0μl精子懸液做動(dòng)態(tài)學(xué)檢查，吸取50μl精子懸液滴片、拉薄技術(shù)制片、染色做形態(tài)學(xué)檢查（方法同優(yōu)化前），剩余標(biāo)本待行宮腔內(nèi)人工授精；不離心直接上游法：準(zhǔn)備8～10個(gè)一次性無菌圓底試管，分別加入1ml經(jīng)37℃、5%CO2平衡過的G-IVFTM-plus液，用可調(diào)移液器吸取8～10等份已液化的精液，直接緩慢地加在圓底試管底部G-IVFTM-plus液的下面，加樣時(shí)不能產(chǎn)生氣泡，然后將這8～10個(gè)圓底試管傾斜45°置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，之后用可調(diào)移液器向每個(gè)圓底試管吸取G-IVFTM-plus上層云霧狀含精子的懸液各100μl，共收集上游液0.8～1.0 ml，置于無菌小試管內(nèi)，同洗滌上游法取樣做精子動(dòng)態(tài)、形態(tài)學(xué)檢查，剩余標(biāo)本待行宮腔內(nèi)人工授精。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差齊的成組t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

90例共130個(gè)周期隨機(jī)采用上述2種上游法處理精液后，精子的動(dòng)態(tài)學(xué)主要參數(shù)，包括密度、活率、活力分級（a+b）較處理前相比均得到明顯提高（均P＜0.05）；正常形態(tài)精子百分率與處理前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），不離心直接上游法優(yōu)化后精子的主要參數(shù)與洗滌上游法優(yōu)化后精子的主要參數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 2種上游法處理精液后精子主要參數(shù)的變化（x±s）

3 討論

上游法和雙層密度梯度離心法是目前精子優(yōu)化處理常用的兩種方法[3]。將精液進(jìn)行離心是精液體外處理中共有的一項(xiàng)操作，盡管優(yōu)選技術(shù)不會增加精子超微結(jié)構(gòu)的損害，對精子染色體也沒有產(chǎn)生影響，然而包括離心等環(huán)節(jié)對精液的體外處理可能會造成精子的物理損傷并形成損害性的過氧化物或其他氧自由基[4-5]，這些有害物質(zhì)會造成精子DNA的損傷并影響精子染色質(zhì)的完整性[6]。有報(bào)道不育男性精子染色體的畸變率明顯高于體細(xì)胞染色體[7]，這可能與采取輔助生殖技術(shù)后有較高的不良妊娠結(jié)局密切相關(guān)[8]。因此，在保證臨床妊娠率的前提下，如何使精子盡量處在一種接近生理狀況下與卵子受精是值得探討的一個(gè)問題。

本文介紹的不離心直接上游法，正是出于上述因素考慮而采取的一種精子體外優(yōu)化的方法。由于上游法同密度梯度離心法相比，回收精子數(shù)量較低[1]，為了在不離心濃縮精子的情況下能夠回收到相當(dāng)數(shù)量活力好的精子，筆者將常規(guī)檢查大致正常并且已充分液化的精液分為8～10等份，分別加樣在G-IVFTM-plus受精液的下面，這樣，有利于精液與受精液充分接觸，相當(dāng)于縮短了精子與受精液之間的距離，擴(kuò)大了精子與受精液接觸的面積；同時(shí)又延長了精子上游的時(shí)間，讓活力好的精子充分上游。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不離心的情況下，同樣可以回收到密度較高、活力較好的精子，與經(jīng)過離心的洗滌上游法相比，精子動(dòng)態(tài)與形態(tài)學(xué)主要參數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，采用這2種上游法優(yōu)化精子后與優(yōu)化前相比，正常形態(tài)精子百分率比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明這2種上游法均不能有效去除畸形精子，可能是上游法使一些活力較好的畸形精子都得到了上游。盡管不離心直接上游法同時(shí)也增加了試劑和耗材的消耗，然而此方法減少了精液離心這一環(huán)節(jié)可能對精子造成的不利影響，并且縮短了精子在CO2培養(yǎng)箱外放置的時(shí)間，最終可以取得與經(jīng)過離心的洗滌上游法同樣的優(yōu)化效果。另外，對那些少精子癥而擬行夫精宮腔內(nèi)人工授精的患者，筆者仍然采用雙層密度梯度離心法。

總之，不離心直接上游法是完全依靠精子克服自身重力和精漿的黏滯阻力向上游動(dòng)到受精液里的一種精子優(yōu)化方法。本研究表明，對于常規(guī)檢查大致正常的精液標(biāo)本，可以考慮采用這種方法來優(yōu)化精子。以后的工作中，筆者將擴(kuò)大不離心直接上游法優(yōu)化精子的樣本例數(shù)，并將隨訪用此方法行夫精宮腔內(nèi)人工授精后患者的妊娠率和妊娠結(jié)局。

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