劉曉薇 孫敬武

胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及體外誘導(dǎo)分化研究

劉曉薇1孫敬武1

目的 探討神經(jīng)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)以及體外誘導(dǎo)分化為毛細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，為神經(jīng)干細(xì)胞移植治療感音神經(jīng)性聾奠定基礎(chǔ)。方法 取胎齡為14.5天的SPF級(jí)昆明小鼠腦組織，采用機(jī)械吹打的方法在無血清培養(yǎng)基中原代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化為毛細(xì)胞樣細(xì)胞，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定神經(jīng)干細(xì)胞以及毛細(xì)胞的免疫表型。結(jié)果 ①在含成纖維細(xì)胞生長因子－2（FGF－2）和表皮生長因子（EGF）的無血清培養(yǎng)液中，神經(jīng)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)6～8代后，其細(xì)胞呈指數(shù)級(jí)增加，增殖的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白（nestin）；②在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后它們能被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)胞樣細(xì)胞，4周后表達(dá)支持細(xì)胞表型。結(jié)論 神經(jīng)干細(xì)胞在體外可以誘導(dǎo)分化為毛細(xì)胞樣細(xì)胞。

神經(jīng)干細(xì)胞； 毛細(xì)胞； 免疫細(xì)胞化學(xué)； 免疫表型； 誘導(dǎo)分化

研究表明，神經(jīng)干細(xì)胞具有多向分化潛能［1］，這使細(xì)胞療法成為可能，為神經(jīng)干細(xì)胞移植治療感音神經(jīng)性聾奠定了基礎(chǔ)。

內(nèi)耳是與聽覺位置覺有關(guān)的感覺器官，有報(bào)道m(xù)oysinⅦa和Brn－3c是毛細(xì)胞特異性免疫表型［2～5］。哺乳動(dòng)物耳被囊的形態(tài)發(fā)生依靠膜迷路上皮始基細(xì)胞與相連的耳周圍間充質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，轉(zhuǎn)化生長因子（transforminggrowth factor， TGF）作為一種信號(hào)多肽可調(diào)節(jié)許多細(xì)胞的類型和分化，包括間充質(zhì)細(xì)胞。1991年Frenz等［6］利用免疫組化的方法對(duì)小鼠胚胎第10、12和14天發(fā)育的聽泡中上皮與間充質(zhì)內(nèi)TGF分布的時(shí)間－空間模式進(jìn)行研究，證實(shí)了TGF參與耳囊形成期間軟骨形態(tài)發(fā)生的調(diào)控，提示TGF在上皮－間充質(zhì)相互作用和耳形態(tài)發(fā)生的調(diào)控中起媒介作用。1992年該學(xué)者［7］又報(bào)道了在胎齡10～16天的小鼠中耳上皮和耳周間充質(zhì)中TGF的表達(dá)情況，通過在培養(yǎng)基中加人TGF后培養(yǎng)物又重新出現(xiàn)胚胎期才出現(xiàn)的軟骨形成過程，證實(shí)了TGF與耳被囊之間有因果關(guān)系。TGF可能是耳蝸基底膜正常發(fā)育過程中的重要因子。本文介紹了胚胎小鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）的分離和體外培養(yǎng)方法，并通過NSCs的增殖曲線、NSCs的分化誘導(dǎo)以及免疫細(xì)胞化學(xué)染色等方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)分離和培養(yǎng)的NSCs在體外有很強(qiáng)的增殖能力，并且在自然分化的條件下具有多向分化潛能，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 SPF級(jí)成年昆明小鼠，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，以雌：雄＝2：1于7：00 Pm配對(duì)合籠，次日8：00 Am檢查，查到黃白色米粒樣陰栓存在，記為孕0.5天，未查到陰栓的次日再觀察，合籠的時(shí)間不超過72小時(shí)。

細(xì)胞培養(yǎng)液采用DMEM／F12無血清培養(yǎng)液。另添加B27（Gibco），20 ng／ml成纖維生長因子－a（FGF－a，Peretech）、20 ng／ml表皮生長因子（EGF，Peretech）為NSCs生長液，加入10 ng／ml轉(zhuǎn)化生長因子（TGF，Peretech）、10%胎牛血清（Hyclone）（目的是使神經(jīng)干細(xì)胞貼壁從而誘導(dǎo)其分化）為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。其他試劑有神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（GFAP，sigma），肌漿球蛋白a（myosina，Santa Cruz），全廣角蛋白（pan－Cytokeratin，Santa Cruz），Brn－3c（Santa Cruz），cy3熒光二抗（中杉），F(xiàn)ITC熒光二抗（中杉），Hoechst33342（Sigma）。

1.2 細(xì)胞分離和培養(yǎng) 將孕鼠解剖后，取出胚胎置于含有D－Hanks液的平皿中取出腦組織，反復(fù)洗滌，剪成1 mm×1mm×1 mm的組織塊后移至離心管中，用拋光的直頭細(xì)滴管輕輕吹打后使之成為細(xì)胞懸液，并通過尼龍網(wǎng)過濾，以除去粘連的纖維組織，將收集的細(xì)胞懸液離心后，重懸于生長液中，用滴管再次吹打，經(jīng)計(jì)數(shù)和活力觀察，將密度調(diào)至1× 106個(gè)／毫升，并以1×105個(gè)／毫升的密度接種于培養(yǎng)瓶中。于5%CO2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)，直到NSCs分裂、增殖形成較大的神經(jīng)細(xì)胞球后再作傳代處理。

1.3 細(xì)胞傳代 當(dāng)神經(jīng)球增大到每球50～100個(gè)細(xì)胞時(shí)即可傳代，傳代時(shí)將神經(jīng)細(xì)胞球移至離心管，低速離心，再加入生長液中，用200μl的槍頭吹打，使之成為單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)和活力觀察，按2：1接種于新的培養(yǎng)瓶中。

1.4 神經(jīng)干細(xì)胞的分化和鑒定 取第二代的神經(jīng)細(xì)胞球吹打成單細(xì)胞后，以1×104個(gè)／片細(xì)胞密度種于預(yù)先用左旋多聚賴氨酸包被的玻片上，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩小時(shí)后做免疫細(xì)胞化學(xué)染色。用nestin標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞。誘導(dǎo)分化3周后，用moysina標(biāo)記毛細(xì)胞樣細(xì)胞，用pan－Cytokeratin標(biāo)記支持細(xì)胞樣細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光染色觀察。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光方法 細(xì)胞爬片后，用4%多聚甲醛固定30分鐘，0.01 mmol／LPBS沖洗5 min，3次；3%過氧化氫室溫下作用5分鐘，0.01 mmol／LPBS沖洗5 min×3次，滴加10%正常山羊血清室溫封閉30分鐘，吸去多余液體，加一抗Nestin 1：200（sigma）；glial fibrillary acid protein（GFAP）1：200（sigma）；moysina1：200（Santa cruse）；pan－Cytokeratin 1：200（Santa cruse）放入濕盒中4℃過夜，0.01 mmol／LPBS沖洗5 min，3次，加入二抗37℃孵育20分鐘，0.01 mmol／LPBS沖洗5 min，3次，滴加SABC，37℃孵育20分鐘，0.01 mmol／LPBS沖洗5 min，3次；滴加DAB顯色，鏡下觀察顯色情況，并用蒸餾水及時(shí)終止顯色；梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

玻片細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30分鐘，室溫涼干，PBS漂洗2 min，3次；3%過氧化氫室溫孵育10 min；PBS漂洗5 min，3次；10%正常羊血清封閉液室溫封閉20 min；棄封閉液；滴加一抗4℃孵育過夜；PBS漂洗5 min，3次；用適當(dāng)比例稀釋的二抗（FITC標(biāo)記的Ig G 1：200，cy3標(biāo)記的Ig G 1：500，用加有BSA的TBS－T配制）室溫孵育30 min（避光黑暗條件下進(jìn)行）；PBS漂洗5 min，3次；H33342孵育15分鐘，PBS漂洗5 min，3次；甘油／PBS封片劑（PBS：甘油＝1：9，p H 8.0～8.5）封片；熒光顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果

在原代細(xì)胞中有不少細(xì)胞碎片和灰暗的死細(xì)胞，活細(xì)胞透亮并且胞體完整，沉于瓶底，部分細(xì)胞早期有貼壁現(xiàn)象。2～3天后已經(jīng)有部分細(xì)胞聚集，以后在生長因子的作用下，約6～7天形成明顯細(xì)胞球，呈懸浮生長，并逐漸長大。取第二代細(xì)胞做免疫細(xì)胞化學(xué)染色及免疫熒光，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的特有標(biāo)志nestin（圖1、2）。

對(duì)原代培養(yǎng)形成的神經(jīng)球通過機(jī)械吹打的方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每一次傳代后細(xì)胞均通過相差顯微鏡觀察活力并計(jì)數(shù)（圖3），發(fā)現(xiàn)其可以被成功傳6代，每代保持和原代基本相同的形態(tài)，并表達(dá)nestin。

將傳代后的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，觀察它們分化的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在接種的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)細(xì)胞開始貼壁分化，7天后形成多角形胞體的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，表達(dá)GFAP（圖4）。3周后，行免疫細(xì)胞化學(xué)染色和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞表型moysina和Brn－3c，卻幾乎不表達(dá)支持細(xì)胞的免疫表型pan－Cytokeratin（圖5），誘導(dǎo)分化4周后有pan－Cytokeration的陽性表達(dá)（圖6）。

圖2 培養(yǎng)細(xì)胞免疫化學(xué)染色及免疫熒光結(jié)果

圖1 原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞 a 24小時(shí)后（×10）；b原代培養(yǎng)7天

圖3 不同時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)

圖4 傳代培養(yǎng)7天后 a貼壁培養(yǎng)7天后（×10）；b貼壁7天GFAP免疫熒光（cy3熒光染色）

圖5 培養(yǎng)細(xì)胞3周后免疫化學(xué)染及免疫熒光結(jié)果 a誘導(dǎo)分化3周后MoysinⅦa免疫組化（×40）；

圖6 4周后免疫化學(xué)染色及免疫熒光結(jié)果 誘導(dǎo)分化4周后Pan－cytokeration陽性表達(dá)（紅色），H33342（藍(lán)色）核染（×20）

3 討論

干細(xì)胞應(yīng)具有以下屬性：①自我維持和自我更新的能力；②具有多種分化潛能，具有分化為本系大部分類型細(xì)胞的能力；③增殖分裂能力；④這種自我更新和多分化潛能可以維持相當(dāng)長的時(shí)間，甚至終生；⑤對(duì)損傷和疾病具有反應(yīng)能力［8，9］。近年來，關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法已有很多報(bào)道，多采取酶消化的方法［10～14］。因?yàn)樾∈蟮哪X組織較軟，用酶不容易掌握消化時(shí)間，因此，本文采用吸管吹打和篩網(wǎng)過濾的方法來進(jìn)行原代培養(yǎng)。

實(shí)際上，從組織中分離的原代細(xì)胞中有較多的雜質(zhì)和其他細(xì)胞，但是由于生長液中不含有血清，其他細(xì)胞漸漸死亡，而神經(jīng)干細(xì)胞在生長因子的作用下逐漸生長，形成細(xì)胞球。隨著培養(yǎng)的繼續(xù)，神經(jīng)干細(xì)胞不斷純化，而且越長越好，這一點(diǎn)從本研究結(jié)果中的細(xì)胞生長曲線可以看出。另外，在細(xì)胞換液時(shí)采取只加液不棄液的方法，這樣可能更利于神經(jīng)干細(xì)胞的生長，因?yàn)樯窠?jīng)干細(xì)胞在生長的同時(shí)可能分泌其他的生長因子，這些生長因子會(huì)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的生長，而且由于神經(jīng)干細(xì)胞是懸浮生長，棄液可能會(huì)丟失部分細(xì)胞。

研究表明，在內(nèi)耳的感覺器官中，由于肌球蛋白Ⅶa和POU家族轉(zhuǎn)錄因子Brn－3c在毛細(xì)胞上的特異性表達(dá)，并在耳蝸和前庭毛細(xì)胞的殘存和功能恢復(fù)中發(fā)揮的重要作用，它們可以作為標(biāo)記蛋白來鑒別毛細(xì)胞的免疫表型，而pan－Cytokeratin則被認(rèn)為是鑒別耳蝸支持細(xì)胞表型的一種蛋白［15，16］。Kojima等［17］將從胎鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)獲得的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并運(yùn)用雙免疫標(biāo)記技術(shù)，獲得同時(shí)帶有Brn－3c和肌球蛋白Ⅶa這兩種毛細(xì)胞標(biāo)記蛋白的毛細(xì)胞免疫表型。另一方面，nestin可作為干細(xì)胞的標(biāo)記［18］。在胎鼠及成年鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)均可見nestin的表達(dá)，而且nesitn的表達(dá)與細(xì)胞增殖周期有著密切的聯(lián)系［19，20］。本實(shí)驗(yàn)采用第一代細(xì)胞（P1）nesitn鑒定神經(jīng)干細(xì)胞，體外誘導(dǎo)3周后，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)moysina有陽性表達(dá)，而pan－Cytokeratin幾乎無陽性表達(dá)，說明是毛細(xì)胞樣細(xì)胞，這與Kojima［17］報(bào)道的相同。分析可能與下列因素有關(guān)：①小鼠的胎齡；②體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子；③誘導(dǎo)分化的時(shí)間；④支持細(xì)胞生長的環(huán)境要求。因此本研究延長誘導(dǎo)分化的時(shí)間至4周時(shí)，發(fā)現(xiàn)pan－Cytokeratin陽性表達(dá)。

毛細(xì)胞損失是造成非遺傳性聾的主要因素，由于毛細(xì)胞的再生能力是非常有限的，由毛細(xì)胞缺失造成的耳聾通常認(rèn)為是不可逆的［21］。能否誘導(dǎo)分化其他器官的細(xì)胞產(chǎn)生毛細(xì)胞或者類毛細(xì)胞，進(jìn)而通過細(xì)胞移植的方法在所需部位定向產(chǎn)生毛細(xì)胞，從而治療耳聾，是目前研究的熱點(diǎn)。Li等［22］采用無血清神經(jīng)球培養(yǎng)方法從成年小鼠的橢圓囊斑分離培養(yǎng)出nestin陽性、具有神經(jīng)干細(xì)胞特性的細(xì)胞，這些細(xì)胞具有自我復(fù)制能力，EGF和IGF－1誘導(dǎo)成為潛在的內(nèi)耳毛細(xì)胞前體細(xì)胞。趙玉林等［23］對(duì)TGF蛋白產(chǎn)物在昆明小鼠內(nèi)耳發(fā)育中的表達(dá)進(jìn)行研究，指出該細(xì)胞因子參與內(nèi)耳的發(fā)育過程，并且對(duì)內(nèi)耳上皮的發(fā)育主要起著促進(jìn)分化的作用。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用TGF誘導(dǎo)分化神經(jīng)干細(xì)胞向毛細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)pan－Cytokeratin和moysina均有陽性表達(dá)。

本研究采用孕14.5天胎鼠的神經(jīng)干細(xì)胞，進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞具有分化為毛細(xì)胞表型及支持細(xì)胞表型的潛能，TGF在分化過程中有著非常重要的作用，為進(jìn)一步移植神經(jīng)干細(xì)胞治療感音神經(jīng)性聾奠定了基礎(chǔ)。

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（2008－05－07收稿）

（本文編輯 周濤）

Primary CuIture of Neurospheres Obtained from FetaI Mouse CentraI Nervous System and Differentiation of Inner Ear Hair CeIIImmunophenotypes in Vitro

Liu Xiaowei，Sun Jingwu
（Department of OtorhionoIaryngoIogy Head and Neck Surgery，HospitaI of Anhui Province，Hefei，230001，China）

Objective To examine whether hair cell immunophenotypes could be derived from the central nervous system（CNS）.Methods We established cell cultures from embryonic day 14.5 fetal mouse brain tissues，and analyzed changes in immunohistochemical features of the CNS cell cultures by induction of differentiation.with FGF－2 and EGF.ResuIts The results of this study showed that neural progenitors obtained from fetal rat CNS generated hair cell immunophenotypes with expression of epitopes of hair cell marker proteins myosin VIIa in vitro.ConcIusion These findings indicate that immature neural progenitors possess the potential to differentiate into hair cell phenotypes.Immature neural progenitors may be useful as materials for cell transplantation therapy for replacement of damaged inner ear hair cells.Key words：central nervous system，hair cell，immunohistochemical，immunophenotype，transdifferentiation.

Neural stem cell； Hair cell； Immuocytochemistry； Immunophenotype； Induced differentiation

10.3969／j.issn.1006－7299.2010.04.017

R339.16

A

1006－7299（2010）04－0372－04

1 安徽省立醫(yī)院耳鼻咽喉科（合肥 230001）

劉曉薇，女，安徽人，住院醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槎茖W(xué)。

孫敬武（Email：sjingwu＠yahoo.com.cn）