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        西北地區(qū)與東北地區(qū)耳聾先證者線粒體DNA 12Sr RNA A1555G突變特點分析

        2010-06-05 15:31:02鮑曉林郭玉芬劉曉雯徐百成
        聽力學(xué)及言語疾病雜志 2010年4期
        關(guān)鍵詞:檢測

        鮑曉林 郭玉芬 劉曉雯 徐百成

        西北地區(qū)與東北地區(qū)耳聾先證者線粒體DNA 12Sr RNA A1555G突變特點分析

        鮑曉林1,2郭玉芬2劉曉雯2徐百成2

        目的 分析西北地區(qū)耳聾先證者與東北地區(qū)線粒體DNA 12Sr RNA 1555位點的突變特點。方法對西北地區(qū)245例、東北地區(qū)188例耳聾先證者抽取靜脈血5~10 ml,提取白細(xì)胞DNA,針對線粒體DNA 12Sr RNA1555位點突變設(shè)計的一對引物序列進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction PCR),然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用Alw26l限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng),不能切開的送測序驗證。結(jié)果 西北地區(qū)245例患者中,86例有氨基糖苷類藥物應(yīng)用史,檢測到21例線粒體DNA 12Sr RNA A1555G同質(zhì)型突變,突變檢出率為24.4%(21/86);東北地區(qū)188例患者中,66例有氨基糖苷類藥物應(yīng)用史,檢測到2例同質(zhì)型突變,1例異質(zhì)性突變,突變檢出率為4.5%(3/66),兩地區(qū)比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)。結(jié)論 西北地區(qū)線粒體DNA 12Sr RNA A1555G突變檢出率顯著高于東北地區(qū),提示在該地區(qū)應(yīng)加強(qiáng)藥物性聾的預(yù)防工作。

        線粒體DNA; 12Sr RNA; 聾

        藥物性聾是線粒體遺傳相關(guān)疾病,目前研究認(rèn)為,線粒體DNA12SrRNA A1555G突變促進(jìn)了氨基糖苷類抗生素與12Sr RNA結(jié)合,從而導(dǎo)致氨基糖苷類抗生素藥物致聾[1]。其耳聾表型的表達(dá)受環(huán)境因素、核基因背景以及線粒體DNA的單體型影響[2]。我國地域遼闊,遺傳性聾有很高的遺傳異質(zhì)性,為了進(jìn)一步探討不同地區(qū)線粒體遺傳性聾的分子流行病學(xué)的特點,本研究對西北地區(qū)和東北地區(qū)433例耳聾先證者進(jìn)行線粒體DNA 12Sr RNA 1555位點突變檢測,并分組進(jìn)行病因、病史等流行病學(xué)調(diào)查,報告如下。

        1 資料與方法

        1.1 研究對象 研究對象來自于西北地區(qū)耳聾患者245例,其中男142例,女103例,年齡1~39歲,中位數(shù)15歲;東北地區(qū)耳聾患者188例,其中男112例,女76例,年齡2~23歲,中位數(shù)16歲。除外綜合征型聾以及因炎癥、外傷或全身疾病所致的耳聾病例。

        1.2 調(diào)查方法

        1.2.1 填寫問卷調(diào)查 根據(jù)王秋菊等[3,4]采用的遺傳性聾資源收集、保存的方法進(jìn)行聾病流行病學(xué)調(diào)查,主要包括患者耳聾的發(fā)生年齡、發(fā)病方式、耳聾的程度、感染史、發(fā)育史、母親的妊娠及分娩史、有無耳毒性藥物用藥史、有無耳聾高危新生兒疾病史以及有無其他系統(tǒng)疾病等。還需注意父母是否為近親結(jié)婚。對部分沒有得到詳細(xì)病史資料的學(xué)生通過電話詢問的方式進(jìn)行補(bǔ)充調(diào)查,完善問卷調(diào)查的內(nèi)容。

        1.2.2 全身及耳鼻咽喉科常規(guī)檢查[5]特別注意全身發(fā)育、眼部及甲狀腺的檢查,以初步排除綜合征型聾,排除因中耳炎、腦膜炎、病毒性腦炎、腮腺炎及全身感染等因素所致的耳聾。

        1.2.3 臨床聽力學(xué)檢測與評估 應(yīng)用純音測聽檢測聽力損失程度;按照Van Camp等[6]聽力損失分級標(biāo)準(zhǔn)評估聽力水平,根據(jù)受試者聽力較好耳0.5、1和2 k Hz純音聽閾平均值(PTA)進(jìn)行聽力分級(不能配合檢查的參考ABR閾值):21~40 dB HL為輕度聾;41~70 d B HL為中度聾;71~95 dB HL為重度聾;>95 dB HL為極重度聾。2歲以前聽力下降為語前聾,2歲以后聽力下降為語后聾。應(yīng)用Madsen901(丹麥)聲導(dǎo)抗檢測儀進(jìn)行鼓室導(dǎo)抗圖及鐙骨肌反射的檢測,了解中耳傳導(dǎo)狀況;應(yīng)用美國智聽公司Smart EP 3.X聽覺誘發(fā)電位儀行聽性腦干反應(yīng)檢查,測定反應(yīng)閾值及判斷是否存在蝸后病變。

        1.3 基因檢測方法 所有耳聾患者及家系成員簽寫知情同意書。抽取所有患者及家系成員靜脈血5~10 ml,用酚氯仿法提取白細(xì)胞DNA。采用王秋菊課題組針對線粒體DNA 12Sr RNA1555位點突變設(shè)計的1對引物序列、反應(yīng)條件和反應(yīng)體系[7],引物由上海生工公司合成,其他試劑由大連寶生物公司生產(chǎn)。PCR反應(yīng)體系在ABI公司9700熱循環(huán)儀完成。PCR反應(yīng)結(jié)束后,取每種PCR產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)Marker各2μl,分別加入6μl溴酚藍(lán),用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行產(chǎn)物純度和濃度的檢測。然后取擴(kuò)增產(chǎn)物6μl,加入Alw26l限制性內(nèi)切酶0.2μl和6×Buffer2μl,加水至20μl,在37℃水浴箱中溫育消化3小時,再次經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證酶切結(jié)果,酶切切開者電泳顯示為300 bp和500 bp兩個條帶,而不能切開的則為800 bp一個條帶。為驗證酶切結(jié)果的準(zhǔn)確性全部送測序驗證。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件的列聯(lián)表(Grosstabs)對兩地區(qū)的結(jié)果差異進(jìn)行卡方檢驗。

        2 結(jié)果

        所有耳聾患者均為雙側(cè)感音神經(jīng)性聾。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,西北地區(qū)與東北地區(qū)耳聾患者在發(fā)病年齡、聽力損失程度和基因突變檢測結(jié)果的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表1)。線粒體DNA12Sr RNA A1555G突變均發(fā)生在有氨基糖苷類藥物應(yīng)用史的患者中。西北地區(qū)的突變檢出率為24.4%(21/86),東北地區(qū)為4.5%(3/66)。

        表1 兩地區(qū)耳聾先證者的病因、病史、聽力損失程度及基因突變檢測結(jié)果(例)

        3 討論

        目前研究普遍認(rèn)為藥物性聾與遺傳密切相關(guān),線粒體DNA 12Sr RNA A1555G的突變可造成患者對氨基糖苷類藥物易感性,是常見的致聾因素。研究藥物性聾的流行病學(xué)對藥物性聾的致聾機(jī)制研究尤為重要。我國幅員遼闊,民族眾多,人口分布和地域環(huán)境復(fù)雜多變,西北地區(qū)與東北地區(qū)地域環(huán)境、人口分布、風(fēng)土人情等都存在較大的差別,針對遺傳與環(huán)境的相關(guān)研究難度很大,群體遺傳規(guī)律以及遺傳與環(huán)境相互作用對藥物性聾存在哪些影響,是相關(guān)研究必須面對和亟待解決的問題。因此,開展藥物性聾的區(qū)域性流行病學(xué)調(diào)查,根據(jù)不同地區(qū)、不同人群中線粒體基因的突變特點,有針對性的進(jìn)行研究,更能夠客觀的反映我國藥物性聾的現(xiàn)狀。

        本研究結(jié)果顯示,西北地區(qū)和東北地區(qū)均有三分之一以上的患者存在著濫用耳毒性藥物的問題,線粒體DNA 12Sr RNA A1555G突變均發(fā)生在有耳毒性藥物應(yīng)用史的患者中,在有氨基糖苷類藥物應(yīng)用史的患者中,西北地區(qū)的A1555G突變檢出率為24.4%(21/86),東北地區(qū)的突變檢出率則為4.5%(3/66),兩地區(qū)線粒體A1555G突變率存在差別,且發(fā)病年齡和耳聾表型方面兩地區(qū)也存在差異(P<0.01),但由于樣本量較少,尚需要實驗設(shè)計的不斷完善以及足夠樣本量的研究進(jìn)一步驗證。線粒體DNA的其他致聾位點的突變是否存在差異還需要繼續(xù)研究。線粒體DNA1555位點的突變使得耳毒性藥物與該位點的結(jié)合更容易,可能是導(dǎo)致藥物性聾的發(fā)病率明顯提高的原因。由此看來,通過線粒體DNA 12Sr RNA A1555G突變檢測,對其突變家系的全體成員進(jìn)行有效的遺傳咨詢和用藥指導(dǎo),嚴(yán)格控制氨基糖苷類抗生素等耳毒性藥物的應(yīng)用范圍和劑量等,為減低此類耳聾的發(fā)生有重要的作用。

        1 Li XM,Guan MX.A human mitochondrial GTP binding protein related to tRNA modification may modulate phenotypic expression of the deafness-associated mitochondrial 12S r RNA mutation[J].Molecular and Cellular Biology,2002,22:7 701.

        2 徐延軍,曹菊陽,白琳娜,等.線粒體DNAA1555G和G7444A雙重突變導(dǎo)致的非綜合征型遺傳性耳聾[J].中華耳科學(xué)雜志,2005,3:263.

        3 王秋菊,楊偉炎,韓東一,等.遺傳性耳聾資源的收集、保存及利用——綜合系統(tǒng)的建立[J].中華耳科學(xué)雜志,2003,1:65.

        4 Stephens D,Lewis P,Davis A.The epidemiology of hearing problem:how should we investigate it[J]?Acta Otolaryngology,2004,522(suppl):13.

        5 謝鼎華,楊偉炎.耳聾的基礎(chǔ)與臨床[M].長沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社,2007.116~149.

        6 http://webhost.ua.ac.be/hhh/varia.Van Camp G,Smith RJH.Hereditary hearing loss homepage.Recommendations for the description of genetic and audiological data for families with nonsyndromic hereditary hearing impairment.

        7 郭玉芬,徐百成,韓東一,等.中國西北地區(qū)線粒體DNA 12Sr RNA A1555G和GJB2基因突變[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科,2006,13:666.

        (2009-12-09收稿)

        (本文編輯 雷培香)

        10.3969/j.issn.1006-7299.2010.04.021

        R764.43

        A

        1006-7299(2010)04-0387-02

        1 天津市泰達(dá)醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(天津 300457); 2 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

        郭玉芬(Email:eygyf@yahoo.com)

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