徐鷗 李志玉 劉硯星 張燕卓 路虹

豚鼠迷路震蕩造模初探△

徐鷗1李志玉1劉硯星2張燕卓1路虹1

目的 借助自制單擺打擊裝置建立腦震蕩動(dòng)物模型，探討迷路震蕩動(dòng)物模型的建立方法。方法 將40只健康豚鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、撞擊后4周組、撞擊后6周組和撞擊后8周組，每組10只。在清醒狀態(tài)下以自制的單擺打擊裝置對(duì)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物頭部實(shí)施一次性打擊，對(duì)照組不予打擊。實(shí)驗(yàn)前后測(cè)試動(dòng)物雙耳DPOAE和ABR。測(cè)試結(jié)束后斷頭處死動(dòng)物，取出耳蝸制作光鏡和透射電鏡標(biāo)本，觀察各組動(dòng)物耳蝸螺旋器和螺旋神經(jīng)節(jié)的病理改變；實(shí)驗(yàn)各組隨機(jī)抽取2只動(dòng)物行腦組織切片，HE染色，觀察腦神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物頭部受打擊后無(wú)顱骨骨折，腦組織病理切片可見神經(jīng)細(xì)胞腫脹和軸索斷裂；與正常對(duì)照組比較，撞擊后4周組DPOAE在0.5、0.7、1、2 k Hz幅值降低；撞擊后6周組僅2 k Hz幅值降低，撞擊后8周組僅1、2 k Hz幅值降低（均P＜0.05）；各實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組比較ABR反應(yīng)閾降低（P＜0.05）。撞擊后4周組和6周組螺旋器隧道變形，毛細(xì)胞排列不整齊，撞擊后8周組螺旋器及毛細(xì)胞未見明顯變化；透射電鏡發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)各組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均有不同程度受損。結(jié)論自制單擺打擊裝置可成功建立腦震蕩動(dòng)物模型；動(dòng)物腦震蕩后聽力及耳蝸毛細(xì)胞功能及螺旋神經(jīng)節(jié)病理變化符合迷路震蕩特點(diǎn)；腦震蕩動(dòng)物模型可適用于制作迷路震蕩動(dòng)物模型。

豚鼠； 迷路震蕩； 動(dòng)物模型； 耳蝸； 螺旋神經(jīng)節(jié)

腦震蕩尤其是迷路震蕩（labyrinthine concussion）所致聽力障礙一直是法醫(yī)學(xué)鑒定的難點(diǎn)之一。以往關(guān)于迷路震蕩的報(bào)道僅涉及迷路震蕩的臨床特點(diǎn)和治療方法，而有關(guān)迷路震蕩動(dòng)物模型的建立及其發(fā)生機(jī)制鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)借助腦震蕩動(dòng)物模型，觀察動(dòng)物腦震蕩后的聽功能改變及內(nèi)耳病理變化，以期證實(shí)腦震蕩同時(shí)常伴有迷路震蕩，即腦震蕩動(dòng)物模型可同樣適用于制作迷路震蕩動(dòng)物模型，從而為臨床研究迷路震蕩發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用40只健康白毛紅目豚鼠，體重250～400 g，雌雄不限（由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），隨機(jī)分為正常對(duì)照組、撞擊后4周組、撞擊后6周組、撞擊后8周組，每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備 美國(guó)產(chǎn)Smart OAE4.41USBZDP－OAE型耳聲發(fā)射系統(tǒng)；日本三榮7S－12型誘發(fā)電位儀；尼康數(shù)碼光鏡照相機(jī)；日本電子公司JEM－1230型透射電鏡。

1.3 自制單擺打擊裝置及腦震蕩動(dòng)物模型的建立

參照劉迎春等［1］方法制作單擺打擊裝置。以木條制成一框，長(zhǎng)50 cm，寬50 cm，高70 cm，在框后側(cè)釘一木板，木板下部固定一泡沫軟墊。在框上方距后側(cè)12 cm處與之平行釘一木條，木條中點(diǎn)下面固定一鐵環(huán)，用于懸掛沖擊錘和線套。線套供掛鉤動(dòng)物上門牙之用，鉤掛后可使動(dòng)物頭部充分后仰，其下頜骨及頸部面向框后木板，頂枕部暴露于后。在木框兩側(cè)框條上，以水平方向向后伸出一V型鉛絲，其尖端正好位于沖擊錘落下后垂直的位置上，以阻擋其繼續(xù)向前擺動(dòng)，避免動(dòng)物頭部被擠壓在鉛錘與軟墊之間造成嚴(yán)重?cái)D壓傷。擺錘是用鉛做成的直徑4 cm，長(zhǎng)8 cm的圓柱體，質(zhì)量1.136 kg，中間鑿一環(huán)形淺溝，連接擺桿，擺桿長(zhǎng)為50 cm。在木板中央，線套與擺桿構(gòu)成的直線處，置一光滑軌道，以避免偏位打擊，角度刻度盤用以測(cè)量擺角。

為模擬臨床腦震蕩發(fā)生情況，豚鼠處于清醒狀態(tài)，安靜溫順，門齒勾于線圈上，助手幫助擺正其頭部，使之在前后方向上處于自由狀態(tài)且在擺錘落下時(shí)正好打在兩耳中間的頂枕部。擺錘以90°角的高度零初速度自由落下1次，即可對(duì)豚鼠頭部造成損傷（圖1）。實(shí)驗(yàn)組各組動(dòng)物均分別完成一次性頭部打擊，正常對(duì)照組不實(shí)施打擊。

圖1 自制單擺打擊裝置

圖2 腦震蕩動(dòng)物模型造模后豚鼠受外力打擊腦組織病理切片

1.4 臨床癥狀觀察及腦組織病理學(xué)檢查 打擊后立刻觀察豚鼠的意識(shí)狀態(tài)、行為、呼吸和心跳，并立即從每組中隨機(jī)選取2只動(dòng)物，以3%戊巴比妥鈉40 mg／kg麻醉后以4%多聚甲醛心臟灌注，取腦組織切片，HE染色，觀察腦組織病理變化。

1.5 聽功能檢查及耳蝸形態(tài)學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)前后測(cè)試動(dòng)物雙耳DPOAE和ABR，測(cè)試結(jié)束后斷頭處死動(dòng)物，取出耳蝸制作光鏡和透射電鏡標(biāo)本。

1.5.1 DPOAE測(cè)試 豚鼠置于電聲和磁場(chǎng)的屏蔽室內(nèi)，2%戊巴比妥鈉40 mg／kg腹腔注射麻醉后，將耳聲發(fā)射系統(tǒng)的聲源與接收器導(dǎo)入外耳道，兩純音的固定頻比為f2／f1＝1.2；刺激聲強(qiáng)度為：L1＝ 65 dB SPL，L2＝55 d B SPL；頻率范圍：以（F1（F2）1／2＝0.5、0.7、1、1.4、2、3、4、6、8 k Hz 9個(gè)頻率點(diǎn)處進(jìn)行測(cè)試，疊加200次，以高于本底噪聲3 dB為反應(yīng)出現(xiàn)的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)。

1.5.2 ABR測(cè)試 動(dòng)物麻醉后將銀盤電極分別置于顱頂正中、鼻背處及雙耳廓，采用Click短聲刺激，強(qiáng)度從90 d B SPL開始，降至反應(yīng)波消失，以波III判定反應(yīng)閾值，每次測(cè)試均重復(fù)兩次確定。

1.5.3 形態(tài)學(xué)觀察 每組動(dòng)物DPOAE與ABR測(cè)試完畢后，以斷頭法處死取出聽泡，暴露耳蝸，蝸尖鉆孔，取出鐙骨，挑破圓窗膜與蝸窗膜，進(jìn)行耳蝸灌注。每組選取5只用于光鏡標(biāo)本制作，3只用于透射電鏡標(biāo)本制作。

1.5.3.1 光鏡標(biāo)本制作 用4%多聚甲醛（4oC，p H＝7.4）緩慢灌流耳蝸5遍，置于固定液4～6小時(shí)后，用0.1mol／L磷酸緩沖液清洗，10%EDTA脫鈣20天，石蠟包埋，平行蝸軸連續(xù)切片，蘇木精－伊紅染色，光鏡觀察。

1.5.3.2 透射電鏡觀察 用4%戊二醛（4oC，p H＝7.4）約5 ml，緩慢灌流耳蝸5遍，置于固定液4～6小時(shí)，10%EDTA脫鈣10～15天，磷酸緩沖液漂洗，解剖顯微鏡下切取各回基底膜，1%四氧化鋨后固定，梯度乙醇脫水，樹脂包埋，超薄切片染色，透射電鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，四組間比較用Dunnett t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及腦組織病理 撞擊即刻豚鼠四肢松軟，5 s后出現(xiàn)痙攣或驚厥狀態(tài)，5～10 min后出現(xiàn)昏迷，角膜反射消失至少10 s，呼吸暫停，心跳減慢＜60%或心跳加速＞10%，約3～4分鐘后清醒，完全符合腦震蕩的臨床表現(xiàn)［1］。動(dòng)物完全清醒后表現(xiàn)出行動(dòng)遲緩，步態(tài)不穩(wěn)，精神差。腦組織解剖過(guò)程中未見顳骨骨折，病理切片檢查可見神經(jīng)細(xì)胞水腫和軸索斷裂，且無(wú)出血（圖2），符合腦震蕩病理改變［］。

2.2 DPOAE測(cè)試結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，撞擊后4周組0.7、1、2 k Hz DPOAE幅值降低；撞擊后6周組僅2 k Hz DPOAE幅值降低；撞擊后8周組僅1、2 k Hz DPOAE幅值降低（均為P＜0.05）（表1）。

表1 對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組DPOAE各頻率幅值

表1 對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組DPOAE各頻率幅值

注：▼與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；●與撞擊后4周組比較，P＜0.05

頻率（k Hz）0.5 0.7 1 1.4 2 3 4 6 8正常對(duì)照組10 5.90±5.84 5.50±0.10 2.39±4.06－13.20±9.45－9.50±15.03－11.80±11.25－11.30±2.91 4.40組別例數(shù)（只）.26 ±9.62 12.20±9.16撞擊后4周組8 6.10±9.16 1.36±0.16▼－1.70±7.24▼－7.60±3.50－12.00±9.76▼－12.00±9.42－10.10±4.36 2.90±5.78 8.50±5.87撞擊后6周組8 6.20±6.21 1.31±0.11●7.80±6.09●－12.50±10.70－17.70±9.84▼－17.30±8.45－10.60±4.53 9.20±7.84 17.60±13.09撞擊后8周組8 5.40±6.38 1.21±0.06 2.40±6.87▼●－8.70±10.23－8.70±10.23▼－12.60±14.42－6.80±4.02 7.00±6.25 10.50±13

2.3 ABR閾值 正常對(duì)照組ABR反應(yīng)閾為13.50±5.30 d B SPL，撞擊后4、6、8周組分別為25.0 ±3.33、19.0±3.16、18.0±3.50 d B SPL。經(jīng)Dunnett t檢驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組相比較，閾值升高（均為P＜0.05）；撞擊后6、8周組較撞擊后4周組閾值降低（P＜0.05），但撞擊后6周組和撞擊后8周組閾值比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

2.4 光鏡觀察 正常豚鼠耳蝸可見螺旋器隧道正常，外毛細(xì)胞排列整齊，刷狀緣清晰（圖3a）；撞擊后4周組，螺旋器隧道增寬變形，毛細(xì)胞排列不整齊，刷狀緣不清晰（圖3b）；撞擊后6周組，螺旋器隧道擠壓變形，毛細(xì)胞排列欠整齊（圖3c）；撞擊后8周組，螺旋器及毛細(xì)胞未見明顯變化（圖3d）。

圖3 各組耳蝸光鏡觀察圖像

圖4 各組耳蝸透射電鏡觀察圖像

2.5 透射電鏡觀察 正常螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核圓、核仁居中，線粒體無(wú)腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均勻分布，溶酶體無(wú)腫脹溶解（圖4a）。撞擊后4周組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體腫脹，空泡樣變（圖4b）；撞擊后6周組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞線粒體嵴個(gè)別消失，線粒體腫脹（圖4c）；撞擊后8周組線粒體腫脹，嵴位于周邊（圖4d）。

3 討論

迷路震蕩（labyrinth concussion）是指內(nèi)耳膜迷路在受到聲波頻率以下的刺激后而出現(xiàn)的震蕩性損傷。震蕩頻率一般為10～20次／秒，常與腦震蕩同時(shí)存在，多不伴有顳骨骨折。其病因多為頭顱外傷，如墜落傷、枕部或顳骨受到機(jī)械重?fù)簦部梢驈?qiáng)力爆炸所致的空氣振動(dòng)沖擊波等。頭部閉合性損傷時(shí)，造成腦脊液循環(huán)障礙，引起腦脊液壓力驟升，壓力可通過(guò)導(dǎo)水管或內(nèi)聽道向外傳至內(nèi)耳，使外淋巴壓力驟升，從而造成迷路損傷，患者傷后除有腦震蕩的癥狀外，部分患者伴有耳鳴、耳聾等［2］。有學(xué)者報(bào)道腦震蕩后遺留聽功能障礙患者占腦震蕩后遺癥的23.2%，僅次于頭暈、頭痛，其病理呈現(xiàn)耳蝸微毛細(xì)血管循環(huán)障礙、突觸損傷等［3～5］。診斷并不困難，只是在頭顱外傷后有腦震蕩時(shí)迷路震蕩常被忽略，患者多在腦震蕩緩解后才就診于耳鼻喉科。

本實(shí)驗(yàn)采用單擺裝置打擊清醒狀態(tài)下的豚鼠制作腦震蕩模型，制作方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便易行，接近人的受傷狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組豚鼠ABR反應(yīng)閾在腦震蕩后第四周達(dá)到最高，此后有所恢復(fù)，但始終未恢復(fù)到打擊前水平，說(shuō)明在此實(shí)驗(yàn)中迷路震蕩對(duì)聽覺系統(tǒng)造成了不可逆的損害。DPOAE主要反映外毛細(xì)胞的功能狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)腦震蕩后豚鼠DPOAE幅值以1、2 k Hz升高為主，說(shuō)明迷路震蕩主要影響此頻率段外毛細(xì)胞的功能。此外，文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)迷路震蕩傷后一定程度的聽力障礙不僅與耳蝸Corti器受損有關(guān)，還與螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的病理改變有聯(lián)系［6，7］。從文中結(jié)果看，實(shí)驗(yàn)組中撞擊后4周組和撞擊后6周組豚鼠耳蝸毛細(xì)胞排列不整齊螺旋器隧道變形，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體腫脹及空泡樣變等病理改變，與文獻(xiàn)相符。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般表現(xiàn)以及聽力學(xué)測(cè)試結(jié)果，說(shuō)明動(dòng)物腦震蕩的同時(shí)伴發(fā)了迷路震蕩，說(shuō)明該自制單擺打擊裝置同樣適用于制作迷路震蕩動(dòng)物模型。

1 劉迎春，石秋念.實(shí)驗(yàn)性腦震蕩腦組織形態(tài)學(xué)改變的動(dòng)態(tài)觀察［J］.浙江醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，25：193.

2 高文元，遲放魯，賀秉坤，等.臨床聽覺生理學(xué)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2004.154～485.

3 Couch JR，Bearss C.Chronic daily headache in the post－trauma syndrome：relation to extent of head injury［J］.Headache，2001，41：559.

4 Korinthenberg R，Schreck J，Weser J，et al.Post－traumatic syndrome after minor head injury cannot be predicted by neurological investigations［J］.Brain Dev，2004，26：113.

5 肖興義，尹小梅，薛關(guān)生.腦震蕩后腦功能障礙與相關(guān)因素回顧性研究［J］.現(xiàn)代康復(fù)，2001，5：20.

6 王文利，路虹，張穎，等.腦震蕩前后大鼠聽力及耳蝸形態(tài)變化［J］.中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007，14：531.

7 路虹，李志玉，韓海霞，等.豚鼠腦震蕩后耳蝸功能及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的病理變化研究［J］.中華耳科學(xué)雜志，2008，6：345.

（2010－04－13收稿）

（本文編輯 李翠娥）

Labyrinthine Concussion ModeIExpIoration

Xu Ou*，Li Zhiyu，Liu Yanxing，Zhang Yanzhuo，Lu Hong
（*Department of OtoIaryngoIogy，the Second HospitaI of Hebei MedicaI University，Shijiazhuang，Hebei，050000，China）

Objective To establish a labyrinthine concussion model by using self－made pendulum shocking model of cerebral concussion.Methods Forty healthy guinea pigs were randomly divided into 4 groups，10 animals per group：normal control group；four weeks post－concussion group；six weeks post－concussion group；eight weeks post－concussion group.The disposable attack was implemented by the self－made pendulum shocking device to the experimental group animals forehead under the coaking condition，while the control group did not receive the same attack.Before and after the treatment，animal binaural distortion product otoacoustic emissions（DPOAE）and auditory brainstem response（ABR）were tested.One day after the experiment test，the animals were decapitated.Otic vesicles were removed immediately，and the cochleas were fixed with different fixatives.The specimens were prepared for light microscopy（LM）and transmission electron microscopy（TEM）.Pathology change of animal cochlea spiral organ and the spiral ganglion in each group were observed.Of 2 animals in each group were randomly selectcd for brain tissue slice，hematoxylin－eosin（HE）dyes，and cerebral nerve cellular morphology observation.After the experimental animals＇forehead were attacked，skull fracture did not happen.Nerve cell swelling and the axis cylinder broken were observed on brain pathological speciments.ResuIts The DPOAE amplitude at 0.5 k Hz，0.7 k Hz，1 k Hz and 2 k Hz in the four weeks post－concussion group were lower than those of normal control group（P＜0.05），the amplitude at 2 k Hz in the six weeks post－concussion group was lower than that of normal control group（P＜0.05），the amplitude at 1 k Hz and 2 k Hz in the eight weeks post－concussion group were lower than those of normal control group（P＜0.05）.The ABR thresholds in all experiment groups were significantly changedthan that of control group（P＜0.05）.The structure of Corti＇s organ was damaged severely in four weeks postconcussion group and six weeks post－concussion group.The line of hair cells was in irregular.While there was no obvious change in eight weeks post－concussion group.The cellular organs of spiral ganglion cells（SGCs）were injured severely in experiment groups.ConcIusion The cerebral concussion model can be established by using selfmade pendulum shocking device.The auditory disfunction and pathological changes occurred in cochlea in guinea pigs with cerebral concussion，which were conformed to labyrinthine concussion characteristic.Thus cerebral concussion model could be used as labyrinthine concussion model.

Guniea pig； Labyrinthine concussion； Animal model； Cochlea； Spiral ganglion

10.3969／j.issn.1006－7299.2010.04.013

R764.34

A

1006－7299（2010）04－0355－04

△ 河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（08276101D－35）

1 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻喉科（石家莊 050000）； 2 河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室作者簡(jiǎn)介：徐鷗，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事內(nèi)耳疾病方面研究

路虹（Email：Luhong12112003＠yahoo.com.cn）