葉海波 時海波 于棟禎 陳正儂 殷善開

高膽紅素血癥對新生豚鼠畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射的影響*

葉海波1時海波1于棟禎1陳正儂1殷善開1

目的 通過動態(tài)觀察高膽紅素血癥新生豚鼠畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（DPOAE）及其對側(cè)抑制現(xiàn)象的變化，探討高膽紅素血癥對耳蝸和／或腦干聽覺傳出通路內(nèi)側(cè)耳蝸橄欖系統(tǒng)功能的影響。方法 20只新生豚鼠分為實驗組和對照組各10只，分別腹腔注射膽紅素100μg／g和等量生理鹽水。兩組于給藥前、給藥后2、4、6、8小時在對側(cè)耳無聲刺激及70 dB SPL白噪聲刺激兩種條件下測試DPOAE，觀察兩組DPOAE及對側(cè)抑制現(xiàn)象的動態(tài)變化。給藥后8小時行全耳蝸基底膜鋪片定量觀察毛細胞損傷情況。結(jié)果 對照組給藥前后DPOAE幅值無變化，對側(cè)抑制現(xiàn)象始終存在。實驗組給藥后DPOAE幅值逐步下降，給藥后2小時起對側(cè)抑制現(xiàn)象消失，其中5只豚鼠在給藥后8小時DPOAE幅值及對側(cè)抑制現(xiàn)象呈現(xiàn)不同程度的恢復。兩組豚鼠耳蝸基底膜鋪片觀察毛細胞形態(tài)未見異常。結(jié)論 高膽紅素血癥早期可能損害耳蝸毛細胞的主動機械活動及耳蝸傳出神經(jīng)系統(tǒng)，此損害部分為可逆性的。DPOAE及其對側(cè)抑制現(xiàn)象是評估膽紅素腦病嚴重程度的有效指標。

高膽紅素血癥； 耳聲發(fā)射； 對側(cè)抑制； 耳蝸傳出系統(tǒng)

60%的新生兒可出現(xiàn)高膽紅素血癥，在某些患兒中可以誘發(fā)中樞神經(jīng)毒性作用，即膽紅素腦?。?］。由于聽覺系統(tǒng)對膽紅素毒性高度敏感，聽覺損傷常常先于其他中樞功能障礙，或者單獨顯癥，甚至在部分“生理性黃疸”患兒中也可出現(xiàn)各種急性或慢性顯現(xiàn)的聽功能損害［2，3］。大量的臨床及基礎研究提示高膽紅素可致聽覺外周與中樞均受損，然而，實驗結(jié)果及結(jié)論并不一致［4～6］，而且缺乏高膽紅素血癥時有關(guān)聽覺外周與中樞功能的同步性研究的報告。

畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（DPOAE）的幅值與耳蝸的主動機制以及耳蝸外毛細胞的功能狀態(tài)相關(guān)。此外，腦干聽覺傳出系統(tǒng)也可影響DPOAE的幅值，一側(cè)聲刺激通過內(nèi)側(cè)耳蝸橄欖系統(tǒng)（medial olivocochlear system，MOCS）形成交叉至對側(cè)耳蝸的抑制性投射，可抑制對側(cè)耳蝸外毛細胞的主動運動、抑制耳聲發(fā)射幅值［7，8］，此即為耳聲發(fā)射對側(cè)抑制效應（contralateral suppression，CS）。本研究通過動態(tài)觀察急性高膽紅素血癥新生豚鼠DPOAE、CS及耳蝸毛細胞圖的變化，探討高膽紅素血癥對耳蝸和／或腦干聽覺傳出通路功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組和前期處理 選用生后5～7天的健康純白紅目豚鼠20只，體重70～120 g，雌雄不拘，耳廓反射靈敏，四肢運動自如，肌張力正常；顯微鏡下清除外耳道耵聹，檢查中耳無炎癥反應。隨機分為生理鹽水對照組和膽紅素實驗組，每組各10只動物。以鹽酸氯胺酮30 mg／kg行后肢肌肉注射麻醉，電熱毯維持肛溫在37.5～38.5℃，局部消毒后切除雙側(cè)耳屏軟骨至完全顯露外耳道口，徹底縫合止血，飼養(yǎng)2～3天傷口愈合后，進行后續(xù)實驗。在預實驗探索測試技術(shù)的過程中發(fā)現(xiàn)，不切除耳屏的動物測得的DPOAE值穩(wěn)定性相對較差，在某些頻率有5 dB左右的波動；而切除耳屏后的測試結(jié)果穩(wěn)定，三次以上的DPOAE曲線可以達到完全重合，且對測試值的影響及動物的傷害均不大，故在正式實驗過程中均采用了上述處理方法。

1.2 高膽紅素血癥動物模型制作 參照陳舜年等［9］的方法建立高膽紅素血癥豚鼠模型，膽紅素溶液均于注射前新鮮配制，避光保存及使用。稱取晶體膽紅素（Sigma公司），每20 mg溶于1 ml 0.5 M NaOH溶液中，加入雙蒸水9 ml，用0.5 M HCl調(diào)節(jié)p H至8.5。實驗組豚鼠腹腔注射膽紅素劑量為100μg／g，對照組豚鼠腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3 行為學評價 參照Shaia的評價標準［5］，依據(jù)豚鼠神經(jīng)行為、軀體運動及對外界刺激的反應，將實驗動物神經(jīng)行為學癥狀分為6個等級：0分為正常；1分為極輕度異常，表現(xiàn)為后肢共濟失調(diào)（運動失調(diào)）；2分為輕度異常，表現(xiàn)為后肢共濟失調(diào)和張力障礙，翻正反射輕度異常；3分為中度異常，表現(xiàn)為后肢共濟失調(diào)和張力障礙進一步加重，翻正反射時間延長；4分為重度異常，表現(xiàn)為運動減少、動作遲緩，甚至俯伏不動、對外界刺激無逃避反應，偶爾表現(xiàn)興奮，易激惹，翻正反射消失；5分為瀕死狀，表現(xiàn)為發(fā)作性的角弓反張、癲癇發(fā)作和瀕死狀呼吸。

1.4 DPOAE檢測 兩組動物均置于符合GB／T16403（1996）標準的隔聲屏蔽室中，采用美國GSI（格雷森－斯塔德勒公司）的GSI 60耳聲發(fā)射儀和診斷用聽力計（AA－38E，RION公司）行DPOAE及CS檢測。給藥前及給藥后2、4、6、8小時分別在對側(cè)耳無聲刺激及噪聲刺激兩種條件下測試DPOAE，記錄DPOAE及CS的動態(tài)變化。

以自制固定器固定豚鼠頭部，將GSI 60耳聲發(fā)射儀探頭以自制橡膠耳塞封套后置于外耳道口，使外耳道完全密封。DPOAE記錄參數(shù)設置如下，原始純音頻率比f2／f1＝1.2，L1＝65 dB SPL，L2＝55 dB SPL，測定在f1＝1、1.3、1.6、2、2.5、3.2、4、5、6.4 k Hz 9個不同頻率時DPOAE的幅值，以DPOAE幅值大于本底噪聲3 dB SPL為引出標準。重復測試2～3次，取各頻率幅值的均值作為各頻率DPOAE的幅值。DPOAE測試完成后，將聽力計耳機插入對側(cè)外耳道口，用支架固定。在70 dB SPL白噪聲持續(xù)刺激下，記錄測試耳的DPOAE幅值，各項測量參數(shù)及方法同前。對側(cè)耳無聲刺激時DPOAE幅值與給予70 dB SPL白噪聲刺激時DPOAE幅值的差值計為△DPOAE，該差值即為對側(cè)抑制，反映耳蝸傳出系統(tǒng)功能狀態(tài)。每次測試間休息數(shù)分鐘，以減少因聽覺疲勞產(chǎn)生的影響。

1.5 耳蝸毛細胞圖 兩組動物在給藥后8小時完成DPOAE檢測后均迅速于過量麻醉下斷頭處死，常規(guī)制備全耳蝸基底膜鋪片［10］，經(jīng)纖毛和表皮板染色（F－actin熒光染色法）后觀察。染色方法簡述如下：將基底膜以0.01 M PBS中漂洗3次，每次5分鐘，隨后移入TRITC phalloidin（鬼筆環(huán)肽，Sigma P1951，1：400），避光放置30分鐘，取出樣品經(jīng)0.01 M PBS漂洗后鋪放于載玻片上的甘油中，基底膜的網(wǎng)狀膜面向上，蓋玻片覆蓋后周緣以中性樹膠封固，在熒光顯微鏡（尼康Eclipse 80i）下觀察。按丁大連等［9］的方法對內(nèi)、外毛細胞進行計數(shù)并將結(jié)果逐一輸入LS軟件，該軟件自動將輸入結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中健康豚鼠的耳蝸毛細胞參考值進行比較并生成耳蝸毛細胞圖。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SAS 8.2統(tǒng)計軟件處理所有數(shù)據(jù)結(jié)果，實驗數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示。兩組間DPOAE幅值的差異性采用單因素方差分析，實驗組豚鼠在有、無對側(cè)耳噪聲刺激下DPOAE反應幅值之間的差異性采用配對t檢驗。實驗組和對照組行為學評分比較采用非參數(shù)分析法Kruskal－Wallis檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 動物模型鑒定及行為學評價 實驗組豚鼠在給藥后2～8小時出現(xiàn)明顯的神經(jīng)行為學改變，以注射后8小時癥狀最為嚴重（表1）。行為學評分經(jīng)Kruskal－Wallis檢驗，每個時間點行為癥狀得分差異均具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2 DPOAE及CS 在對側(cè)耳無聲刺激狀態(tài)下，對照組給藥前、后檢測耳DPOAE幅值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；實驗組給藥后各頻率DPOAE幅值下降，隨時間的推移其幅值進一步下降；實驗組給藥后2、4、8小時DPOAE幅值與對照組及給藥前相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

與對側(cè)耳無聲刺激相比，用藥前對側(cè)耳給予噪聲刺激兩組豚鼠的DPOAE幅值均有降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與給藥前相比，對照組給藥后各個時間點的△DPOAE未出現(xiàn)明顯變化（P＞0.05）。實驗組給藥后各時間點之間的△DPOAE逐漸降低并最終趨于0，與給藥前相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表3）；其中5只豚鼠給藥后8小時△DPOAE有不同程度的恢復。

2.3 耳蝸毛細胞圖 與正常對照組豚鼠相比，實驗組豚鼠腹腔注射膽紅素后8小時耳蝸基底膜鋪片及耳蝸毛細胞圖無異常（圖1、2）。

3 討論

大量的臨床及動物實驗研究［2，3，11］已經(jīng)證實高膽紅素血癥可損傷包括腦干聽覺核團在內(nèi)的特定區(qū)域，如蒼白球、丘腦下核、海馬、動眼神經(jīng)核、耳蝸腹側(cè)核及小腦皮層Purkinje細胞。膽紅素腦病是高膽紅素血癥常見的并發(fā)癥，嚴重威脅人類的健康?，F(xiàn)已明確，未結(jié)合膽紅素，亦稱游離膽紅素是主要致病物質(zhì)，它可通過興奮毒性作用及影響能量代謝造成特定的中樞功能障礙［2，4］。豚鼠腹腔注射游離膽紅素溶液后，膽紅素經(jīng)體液吸收進入血液循環(huán)，在給藥4～8小時后血清膽紅素濃度明顯增高，并出現(xiàn)異常神經(jīng)行為［9］。本研究使用的新生豚鼠聽力發(fā)育階段與新生兒相似，非常適合出生早期高膽紅素血癥導致聽覺損害的研究。

表1 兩組豚鼠各時間點的行為學評分（分）（n＝10）

表2 各頻率兩組豚鼠用藥前后DPOAE幅值變化

表2 各頻率兩組豚鼠用藥前后DPOAE幅值變化

注：*與前一個時間點比較，P＜0.05

f1（k Hz）對照組給藥前 給藥后2小時 給藥后4小時 給藥后8小時實驗組給藥前 給藥后2小時 給藥后4小時 給藥后8小時1 5.05±2 5.69±2.89 5.8±1.84 5.35±2.63 7.1±2.84 4.1±2.18*3.55±1.45*2.55±0.56*1.3 6.9±4.32 7.94±3.38 7.65±4.9 7±4.03 8.2±5.42 6.2±4.61*4.45±2.57*4.6±2.12*1.6 9.9±4.43 12.19±6.63 11.25±6.87 10.75±5.82 5.25±2.9 2.9±1.89*3.2±1.54*2.65±1.79*2 13.9±8.47 16.06±8.6 16.05±7.59 15.35±6.77 7.65±4.14 4±2.89*3.3±1.99*3.1±1.22*2.5 16.65±7.62 17.69±7.5 18.1±7.98 17.35±8.63 10.15±4.22 7.35±2.84*6.9±2.44*5.4±3.02*3.2 15.7±6.09 16.75±6.92 16.4±6.66 16.35±5.86 15.05±2.92 10.7±2.55*8.45±4.55*6.1±4.63*4 11.95±6.47 15.38±4.59 13.95±4.42 13.8±4.02 16.95±1.98 13.15±3.33*8.5±6.67*5±2.99*5 11.8±5.99 14.38±5.68 15.7±4.38 14.75±5.29 18.5±2.45 15.3±1.62*11.3±4.91*10.4±4.06*6.4 19.8±6.54 21.19±6.19 20.05±5.5 20.75±5.28 26.4±5.24 24.9±4.03*21.25±6.44*17.25±9.3*

表3 各頻率兩組豚鼠給藥前后對側(cè)耳無聲刺激與對側(cè)耳給予70 d B SPL白噪聲時DPOAE振幅的差值（dB，n＝10）

圖1 兩組豚鼠給藥后8小時的耳蝸毛細胞缺失圖a.對照組（n＝10）；b.實驗組（n＝10）

圖2 實驗組給藥后8小時的耳蝸毛細胞鋪片，未見纖毛或表皮板損害表現(xiàn)（F－actin熒光染色×400）

對于高膽紅素血癥時耳蝸是否受累一直存在爭議。Lafreniere等［12］于1993年報道了在高膽紅素血癥患兒中能夠引出DPOAE，提示耳蝸功能正常，損害部位在蝸后。然而，Sheykholeslami等［13］對3例嚴重高膽紅素血癥所致聾兒的臨床研究表明，所有患兒的OAE（包括DPOAE和TEOAE）均異常，只能引出部分低頻或高頻的反應，提示至少部分耳蝸外毛細胞功能受損。本研究中實驗組豚鼠的耳蝸基底膜鋪片及耳蝸毛細胞圖顯示，新生豚鼠腹腔注射膽紅素后8小時的內(nèi)、外毛細胞圖正常，毛細胞的纖毛和表皮板未見損傷。這與Shapiro等［5，14］利用生后16至17天的先天性高膽紅素血癥大鼠模型（Gunn rat）檢測耳蝸微音器電位、耳蝸毛細胞鈣調(diào)節(jié)蛋白、微清蛋白的表達所證實的耳蝸毛細胞不受高膽紅素血癥影響的結(jié)果相符合。然而本研究結(jié)果顯示，實驗組豚鼠在給藥后各頻率的DPOAE振幅下降，且隨時間的推移逐步加重；給藥后8小時，行為學異常表現(xiàn)最為嚴重，DPOAE幅值下降也最顯著。推測DPOAE幅值下降的直接原因可能與高膽紅素血癥早期損害了耳蝸毛細胞耗能的主動機械活動有關(guān)。

王洪田等［15］研究發(fā)現(xiàn)，動物在去大腦強直后的DPOAE幅值顯著下降，提示聽皮層高級中樞對耳聲發(fā)射存在正向調(diào)控作用。本實驗中，實驗組動物出現(xiàn)了顯著的膽紅素腦病表現(xiàn)，因此，推測高膽紅素血癥時聽皮層功能受到抑制，聽皮層高級中樞對耳聲發(fā)射正向調(diào)控作用減弱，進而導致DPOAE幅值下降。

對側(cè)聲刺激可抑制耳聲發(fā)射幅值的現(xiàn)象已在哺乳動物及人類檢測中得到證實［16，17］。該現(xiàn)象的解剖學基礎在于，一側(cè)聲刺激可誘發(fā)交叉至對側(cè)MOCS的腦干聽覺傳出通路，并通過釋放乙酰膽堿影響MOCS傳出神經(jīng)纖維支配的外毛細胞，抑制對側(cè)外毛細胞的主動運動，引起DPOAE幅值的下降［18～20］。因此，觀察耳聲發(fā)射的對側(cè)聲抑制現(xiàn)象可以了解聽覺腦干傳出通路的功能。本研究實驗組動物在腹腔注射膽紅素后2小時即記錄不到CS，提示膽紅素作用后聲刺激無法興奮MOCS，因此，不能抑制對側(cè)外毛細胞的能動性，DPOAE的幅值不再下降，說明高膽紅素血癥早期即可造成腦干聽覺傳出通路的病理性損害。實驗組有5只豚鼠在給藥后8小時DPOAE幅值及CS出現(xiàn)不同程度的恢復，提示膽紅素對MOCS傳出神經(jīng)系統(tǒng)的損傷有部分是可逆的。

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（2009－11－09收稿）

（本文編輯 周濤）

Effect of HyperbiIirubinemia on Distortion Product Otoacoustic Emissions in Newborn Guinea Pigs

Ye Haibo，Shi Haibo，Yu Dongzhen，Chen Zhengnong，Yin Shankai
（Department of OtoIaryngoIogy，AffiIiated Sixth PeopIe’s HospitaI，Shanghai Jiao Tong University，Institute of OtoIaryngoIogy，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai，200233，China）

Hyperbilirubinemia； Otoacoustic emissions； Contralateral suppression； Medial olivocochlear system

10.3969／j.issn.1006－7299.2010.04.012

R764.5

A

1006－7299（2010）04－0350－05

* 2008年度上海市科委“創(chuàng)新行動計劃”基礎研究重點項目基金（08JC1412700）及2007年度教育部留學回國人員科研啟動基金資助

1 上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，上海交通大學耳鼻咽喉科研究所，上海交通大學眩暈疾病診治中心，上海市聽力測試中心（上海 200233）

葉海波，男，上海人，主治醫(yī)師，在讀博士。研究方向：耳科學基礎和臨床。

時海波（Email：haibo99＠hotmail.com）

【Abstract】Objective To explore the function of cochlea and medial olivo cochlear system（MOCs）in hyperbilirubinemic guinea pigs by detecting the distortion product otoacoustic emissions（DPOAEs）and contralateral suppression（CS）.Methods The DPOAEs amplitude was measured with and without 70 d B SPL white noise contralateral stimulation in the ears of 20 healthy newborn guinea pigs，which were randomly divided into two groups（control group and experimental group）.DPOAE was recorded at 2，4，6 and 8 hours after peritoneal injection of saline for control group，and bilirubin for experimental group.Cochleogram was obtained from cochlear surface preparation in experimental group after the test.ResuIts There was no statistical change in DPOAEs amplitude and CS in control group.However，the amplitude of DPOAEs decreased in experimental group，the contralateral acoustic stimulation had no significant effect on amplitude of DPOAEs measured ipsilaterally after bilirubin injection.There was part of recovery on amplitude of DPOAEs and CSin five guinea pigs with no abnormalities in cochlear hair cells in experimental group at 8 hours after peritoneal injection.ConcIusion Our findings suggest that hyperbilirubinemia results in impairment of MOCs and mechanical activities of cochlear hair cells.The bilirubin injected animals showed some part of reversal of abnomalities.The DPOAEs and CS could be an effective ways to evaluate the severity of bilirubin encephalopathy.