朱光潔 徐琳 高下 陳杰 丁小瓊 麻曉峰 陸玲 秦小明 周函 崔昕燕

小鼠內(nèi)耳圓窗基因?qū)氲膶?shí)驗(yàn)研究△

朱光潔1，2徐琳2高下2陳杰2丁小瓊2麻曉峰2陸玲2秦小明2周函2崔昕燕2

目的 研究攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）腺病毒（Ad－EGFP）經(jīng)由小鼠耳后圓窗徑路導(dǎo)入內(nèi)耳的可行性，分析EGFP在耳蝸內(nèi)的表達(dá)特點(diǎn)。方法 19只健康的8～9周齡C57BL／6J雄性小鼠隨機(jī)分為三組：Ad－EGFP組7只，人工外淋巴液組6只，兩組通過(guò)耳后切口圓窗徑路注射，分別導(dǎo)入Ad－EGFP和人工外淋巴液；空白對(duì)照組6只，未予處理。各組均于術(shù)前3日和術(shù)后7日行聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）檢查；術(shù)后7日取出耳蝸于熒光顯微鏡下觀察EGFP在內(nèi)耳的分布并行免疫組化觀察EGFP在基底膜的表達(dá)。結(jié)果 3組動(dòng)物術(shù)前ABR反應(yīng)閾差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），術(shù)后7日，Ad－EGFP組ABR反應(yīng)閾為62.86±9.94 dB SPL，人工外淋巴液組ABR反應(yīng)閾為60.83±9.70 dB SPL，均較術(shù)前（37.86±8.59和34.16± 8.04 d B SPL）及空白對(duì)照組（40.83±8.61 dB SPL）高（P值均＜0.05）；空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后ABR反應(yīng)閾無(wú)變化，Ad－EGFP組與人工外淋巴液組術(shù)后7天ABR反應(yīng)閾差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。Ad－EGFP組Ad－EGFP導(dǎo)入后在基底膜上可見(jiàn)EGFP呈廣泛表達(dá)，人工外淋巴液組和空白對(duì)照組基底膜未見(jiàn)熒光表達(dá)。結(jié)論 外源性基因可經(jīng)內(nèi)耳圓窗導(dǎo)入并在耳蝸基底膜上廣泛表達(dá)。

基因轉(zhuǎn)導(dǎo)； 圓窗； 腺病毒； 小鼠； EGFP

內(nèi)耳基因治療作為感音神經(jīng)性聾的新興手段目前研究廣泛，合理的手術(shù)入路及良好的動(dòng)物模型是內(nèi)耳基因治療能夠得以實(shí)施的研究基礎(chǔ)。作為經(jīng)典的動(dòng)物模型，豚鼠和大鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)了內(nèi)耳基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)的可行性［1，2］。小鼠作為遺傳學(xué)研究的動(dòng)物模型，近年來(lái)，引起了耳科學(xué)界的關(guān)注［3～5］，如將遺傳性聾小鼠和內(nèi)耳基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)良好的結(jié)合，將可能為人類(lèi)遺傳性聾找到一條新的治療途徑。然而，鑒于小鼠內(nèi)耳的解剖特點(diǎn)，怎樣將攜帶目的基因的載體成功導(dǎo)入體積微小的耳蝸是實(shí)驗(yàn)研究中的主要難點(diǎn)，選擇合適的手術(shù)入路十分重要。本研究采用經(jīng)圓窗鼓階顯微注射法，通過(guò)將攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的腺病毒（Ad－EGFP）經(jīng)耳后入路圓窗導(dǎo)入，觀察腺病毒能否轉(zhuǎn)導(dǎo)入小鼠內(nèi)耳并進(jìn)行相應(yīng)蛋白的表達(dá)，以期為后續(xù)的目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)遺傳性聾小鼠內(nèi)耳實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒（Ad－EGFP，滴度：1×109PFU）由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所張文程博士提供。

1.2 動(dòng)物分組 健康的8～9周齡C57BL／6J小鼠19只，雄性，體重20～30 g（南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供）。隨機(jī)分成三組：Ad－EGFP組7只，人工外淋巴液組6只，空白對(duì)照組6只。Ad－EGFP組及人工外淋巴液組均以左耳作為手術(shù)耳，分別于術(shù)中經(jīng)圓窗注入Ad－EGFP及人工外淋巴液；空白對(duì)照組正常飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.3 內(nèi)耳圓窗基因?qū)敕椒?Ad－EGFP組和人工外淋巴組動(dòng)物以三溴乙醇（2，2，2－Tribromoethanol）500 mg／kg腹腔注射麻醉，在手術(shù)顯微鏡下，沿術(shù)側(cè)耳根部外側(cè)弧形切開(kāi)皮膚及皮下組織，沿肌腱剪斷胸鎖乳突肌，暴露下方二腹肌后腹和聽(tīng)泡后壁。在高倍鏡下用尖鑷咬開(kāi)聽(tīng)泡，暴露鐙骨動(dòng)脈及上方圓窗，將微量注射器內(nèi)1μL Ad－EGFP重組腺病毒或人工外淋巴液經(jīng)圓窗緩慢注入耳蝸，取預(yù)先備好的脂肪迅速封堵圓窗，耳腦膠覆蓋脂肪塊，分層縫合切口，37℃熱臺(tái)復(fù)蘇。

1.4 聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）測(cè)試 各組動(dòng)物分別于術(shù)前3天和術(shù)后7天應(yīng)用TDT system3（Tucker－Davis Technologies，美國(guó)）系統(tǒng)行ABR測(cè)試（均測(cè)試左耳）。測(cè)試于隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，小鼠俯臥位于測(cè)試臺(tái)上，顱頂為記錄電極，測(cè)試耳為參考電極，鼻尖處接地線。刺激聲為短聲（click），疊加1 024次，濾波帶寬10～3 000 Hz，給聲范圍110 dB至0 dB終止，以給聲刺激至少能引出波I及波II并與上一波形有延續(xù)性為閾值判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 耳蝸基底膜鋪片及免疫熒光染色 于術(shù)后7天斷頸處死動(dòng)物，迅速挑開(kāi)聽(tīng)泡，取出耳蝸，置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（p H 7.4）中，在體式熒光顯微鏡下（Leica，德國(guó)）進(jìn)行內(nèi)耳外觀形態(tài)觀察后，于解剖顯微鏡下（Leica，德國(guó)）進(jìn)行蝸?lái)敶蚩?，開(kāi)放圓窗及卵圓窗。4℃固定過(guò)夜，10%EDTA室溫脫鈣三天，基底膜鋪片。

基底膜鋪片標(biāo)本經(jīng)PBS洗后0.3%的Triton X－100破膜10分鐘。PBS洗后5%BSA封閉組織30分鐘后，加1：100稀釋兔抗鼠EGFP（Santa Cruze，美國(guó)）一抗4℃濕盒過(guò)夜。PBS洗后加1：200羊抗兔488標(biāo)記二抗（Pierce，美國(guó)），室溫30分鐘，濕盒閉光。PBS洗后50%甘油磷酸鹽溶液封片，激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP的分布并拍片（Leica，德國(guó)）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各組ABR反應(yīng)閾比較采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包中方差分析和t檢驗(yàn)分析處理，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組術(shù)前3天及術(shù)后7天ABR反應(yīng)閾 術(shù)前3天三組間ABR反應(yīng)閾比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Ad－EGFP組及人工外淋巴液組術(shù)后7天與術(shù)前3天及空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ad－EGFP組與人工外淋巴液組術(shù)后7天比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 各組動(dòng)物手術(shù)前后ABR閾值

表1 各組動(dòng)物手術(shù)前后ABR閾值

注：*與同組術(shù)前3天比較，P＜0.05；△與空白對(duì)照組術(shù)后7天比較，P＜0.05

組別耳數(shù)術(shù)前3天術(shù)后7天Ad－EGFP組7 37.86±8.59 62.86±9.94*△6 40.00±7.07 40.83±8.61人工外淋巴液組6 34.16±8.04 60.83±9.70*△空白對(duì)照組

2.2 動(dòng)物術(shù)后中、內(nèi)耳外觀觀察 術(shù)后無(wú)動(dòng)物死亡，術(shù)后7天取材時(shí)見(jiàn)動(dòng)物中耳腔內(nèi)清潔，未見(jiàn)中耳及內(nèi)耳炎癥、出血等反應(yīng)。體式熒光顯微鏡下可見(jiàn)Ad－EGFP組EGFP的表達(dá)部位包括內(nèi)耳的圓窗、前庭窗及聽(tīng)小骨、鐙骨動(dòng)脈及耳蝸附近軟組織等廣泛區(qū)域；剝開(kāi)耳蝸骨壁，則可見(jiàn)血管紋、螺旋韌帶、基底膜和骨螺旋板等部位有大量熒光表達(dá)（圖1）。人工外淋巴液組（圖2）和空白對(duì)照組雙側(cè)耳蝸則無(wú)熒光表達(dá)。

2.3 基底膜免疫熒光觀察結(jié)果 Ad－EGFP組基底膜鋪片Corti器形態(tài)良好，熒光表達(dá)部位包括從頂回到底回的支持細(xì)胞區(qū)域、骨螺旋板區(qū)域、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等（圖3）。人工外淋巴液組和空白對(duì)照組雙側(cè)耳蝸基底膜鋪片未見(jiàn)EGFP表達(dá)。

3 討論

小鼠是發(fā)育、分化及疾病在基因水平研究的最主要的動(dòng)物模型，與人類(lèi)基因型有極高的同源性，內(nèi)耳結(jié)構(gòu)和功能與人類(lèi)極為相似，基因打靶技術(shù)可在小鼠體內(nèi)進(jìn)行人類(lèi)耳聾基因的研究等［6～8］，因此，小鼠作為內(nèi)耳基因治療研究的模式動(dòng)物，有明顯的優(yōu)點(diǎn)。但由于小鼠內(nèi)耳的解剖結(jié)構(gòu)的特殊性也使其成為困擾實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行外源基因?qū)氲钠款i，如小鼠耳蝸體積小，外淋巴容積僅為0.6μl，限制了導(dǎo)入外源基因的體積；耳蝸骨壁較脆，對(duì)鉆孔技術(shù)要求高；鐙骨動(dòng)脈緊貼圓窗龕下方，手術(shù)過(guò)程中易觸碰之造成大出血［4，5］。

圖1 熒光顯微鏡下Ad－EGFP組術(shù)側(cè)耳蝸大體標(biāo)本 圓窗附近及頂轉(zhuǎn)均可見(jiàn)EGFP陽(yáng)性綠色熒光信號(hào)（×16）

圖2 熒光顯微鏡下人工外淋巴液組術(shù)側(cè)耳蝸大體標(biāo)本 未見(jiàn)EGFP陽(yáng)性綠色熒光信號(hào)（×16）

圖3 激光共聚焦顯微鏡下Ad－EGFP組術(shù)側(cè)耳蝸基底膜免疫組化鋪片 基底膜上EGFP呈廣泛表達(dá)（×200）

目前，載體經(jīng)外淋巴導(dǎo)入的途徑主要有聽(tīng)泡上打孔及聽(tīng)泡外途徑兩類(lèi)，其中，聽(tīng)泡上打孔又可分為經(jīng)圓窗鼓階顯微注射、微滲透泵導(dǎo)入或圓窗膜上粘貼浸泡治療介質(zhì)的明膠海綿三種經(jīng)圓窗途徑［9，10］及耳蝸切開(kāi)鼓階顯微注射、微滲透泵導(dǎo)入兩種途徑［11，12］；聽(tīng)泡外途徑包括聽(tīng)泡外鼓階顯微注射法和外半規(guī)管切開(kāi)顯微注射法［13，14］。經(jīng)圓窗及耳蝸切開(kāi)直接注射是耳蝸轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入的經(jīng)典方法，定位確切，轉(zhuǎn)入效率高，但破壞了聽(tīng)泡結(jié)構(gòu)的完整性，有可能影響聲音的傳入。明膠海棉浸入脂質(zhì)體及腺病毒載體貼圓窗膜法能成功地將外源基因經(jīng)完整圓窗膜導(dǎo)入耳蝸內(nèi)的許多組織中并得到表達(dá)，但也要破壞聽(tīng)泡本身。經(jīng)半規(guī)管和聽(tīng)泡外鼓階途徑也能夠?qū)⑥D(zhuǎn)基因載體成功導(dǎo)入并保持了聽(tīng)泡的完整性，但可能會(huì)致前庭功能受損。故怎樣將攜帶目的基因的載體成功導(dǎo)入體積微小的小鼠內(nèi)耳中并保持術(shù)后無(wú)聽(tīng)力下降是實(shí)驗(yàn)研究中的主要難點(diǎn)，選擇一條合適的手術(shù)入路十分重要。

考慮到小鼠耳蝸相對(duì)容積小，操作困難，本研究采取了經(jīng)圓窗膜導(dǎo)入的方法，成功地將Ad－EGFP轉(zhuǎn)染至耳蝸各部位，實(shí)現(xiàn)了腺病毒在內(nèi)耳的成功轉(zhuǎn)染，分析原因可能與實(shí)驗(yàn)過(guò)程中緩慢注入約1μl腺病毒載體后迅速用脂肪封堵，有效的預(yù)防了液體外漏有關(guān)。然而，腺病毒在內(nèi)耳的轉(zhuǎn)染部位卻不能人為控制，有很大的隨機(jī)性，與腺病毒在淋巴液中的運(yùn)動(dòng)有關(guān)，這可能需要運(yùn)用更有細(xì)胞針對(duì)性的新型載體來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

從文中結(jié)果看，術(shù)后Ad－EGFP組、人工外淋巴液組聽(tīng)力均較術(shù)前有所下降（P＜0.05），兩組術(shù)后聽(tīng)力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢?jiàn)，圓窗膜導(dǎo)入方法影響了小鼠的術(shù)后聽(tīng)力，其原因可能為：一是破壞圓窗膜，影響了聽(tīng)骨鏈、外淋巴液機(jī)械能的傳遞與釋放，造成了傳導(dǎo)性聾；二是液體導(dǎo)入過(guò)程中對(duì)膜迷路產(chǎn)生的機(jī)械損傷。

目前應(yīng)用于耳蝸的轉(zhuǎn)基因載體主要包括病毒類(lèi)和非病毒類(lèi)，其中病毒類(lèi)包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、慢病毒等；非病毒類(lèi)有脂質(zhì)體、納米材料等。非病毒載體無(wú)免疫原性，有研究證實(shí)能夠攜EGFP成功轉(zhuǎn)染內(nèi)耳［15，16］，但由于其轉(zhuǎn)染效率低，不能長(zhǎng)期表達(dá)，目前應(yīng)用較少。腺病毒是轉(zhuǎn)基因研究中最常用的載體，導(dǎo)入效率明顯高于逆轉(zhuǎn)錄病毒，能夠制備較高滴度的病毒，且對(duì)非分裂細(xì)胞也具有很好的感染性，雖然免疫原性不可避免，但某些亞型幾無(wú)致病性。故本研究選用了腺病毒作為載體，結(jié)果顯示能夠?qū)⒒虺晒D(zhuǎn)染細(xì)胞且未見(jiàn)明顯炎癥反應(yīng)，為下一步的內(nèi)耳轉(zhuǎn)基因治療打下基礎(chǔ)。

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（2009－11－09收稿）

（本文編輯 雷培香）

Gene DeIivery through Round Window Membrane in Mouse Inner Ear

Zhu Guangjie*，Xu Lin，Gao Xia，Cheng Jie，Ding Xiaoqiong，Ma Xiaofeng，Lu Ling，Qin Xiaomin，Zhou Han，Cui Xinyan
（*The medicaI coIIege of Southeast University，Nanjing，210009，China）

Objective To investigate the expression of enhanced green fluorescence protein（EGFP）in inner ear of mice by microinjecting through the round window membrane with adenoviral vectors.Methods 19 healthy C57BL／6J mice were selected and divided into three groups：Ad－EGFP group，artificial perilymphatic fluid group and control group.7 mice were microinjected Ad－EGFP through round window membrane，6 mice were implanted with artificial perilymphatic fluid，and the left 6 mice were maintained as controls.Auditory brainstem response（ABR）thresholds were tested in all animals three days before surgery and seven days after surgery.All animals were sacrificed and the surface preparations of basilar membrane were carried out seven days after surgery.ResuItsABR results showed that this surgery had significant side－effect on the hearing of mice，but there was no significant difference between Ad－EGFP group and artificial perilymphatic fluid group after mircoinjection.Bright green fluorescence in cochleae was observed in Ad－EGFP group while artificial perilymphatic fluid group and control group were free of fluorescence.ConcIusion The transgenic technique can successfully deliver EGFP into the inner ear by microinjection through round window membrane.

Gene transfer； Round window； Adenovirus； Mouse； EGFP

10.3969／j.issn.1006－7299.2010.04.011

R764.9＋3

A

1006－7299（2010）04－0347－04

△ 國(guó)家自然科學(xué)基金（30973302）、江蘇省重點(diǎn)人才項(xiàng)目基金（RC2007010）、南京市醫(yī)學(xué)科技重點(diǎn)項(xiàng)目基金（ZKX06019）資助項(xiàng)目1 東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院（南京 210009）； 2 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科

朱光潔，女，江蘇人，碩士研究生，研究方向：聽(tīng)力學(xué)基礎(chǔ)研究。

高下（Email：xiagao213＠yahoo.com.cn）