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        慢性乙型肝炎患者HBV基因型和亞型分布調(diào)查

        2010-06-04 06:45:12殷繼明金榮華孫煥琴于洪波孫殿興馮常煒魏少峰
        實(shí)用肝臟病雜志 2010年1期
        關(guān)鍵詞:血清檢測(cè)研究

        殷繼明 金榮華 嚴(yán) 艷 孫煥琴 于洪波 王 鋒 孫殿興 馮常煒 魏少峰 李 卓

        根據(jù)乙型肝炎病毒(HBV)全基因組序列異質(zhì)性≥8%或S 基因序列≥4%,已將HBV 分為A~H 8個(gè)基因型。不同基因型又可進(jìn)一步分為不同亞型,現(xiàn)有研究表明,我國(guó)流行的HBV 基因型主要為B 基因型和C 基因型,其中北方以C 型為主,南方以B 型為主。不同基因亞型在我國(guó)的流行情況如何,是否與臨床疾病進(jìn)展有關(guān)還需要進(jìn)一步探討。本研究應(yīng)用基因型和基因亞型特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增HBV DNA,根據(jù)擴(kuò)增片斷的大小判斷HBV 基因型和基因亞型,對(duì)我國(guó)部分城市660 份慢性乙型肝炎患者血清進(jìn)行了HBV 基因型和基因亞型檢測(cè)。

        材料與方法

        一、血清標(biāo)本 采集660 例慢性乙型肝炎患者血清,其中北京474 例、長(zhǎng)春55 例、大連20 例、西安26例、石家莊40 例、鄭州33 例、合肥12 例。全部血清標(biāo)本均為HBV DNA 陽(yáng)性。臨床診斷參照2005年慢性乙型肝炎防治指南的標(biāo)準(zhǔn)[5]。

        二、血清學(xué)檢測(cè) 采用ELISA 法檢測(cè)乙型肝炎血清標(biāo)記物(北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司);采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)血清HBV DNA(杭州博賽基因診斷技術(shù)有限公司)。

        三、HBV DNA 基因型和基因亞型的檢測(cè) Taq DNA 聚合酶、dNTPs 及 DNA Marker 購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心。參照文獻(xiàn)[6,7]并結(jié)合我國(guó)已經(jīng)發(fā)表的B和C 基因型的序列設(shè)計(jì)引物,檢測(cè)HBV 基因型和基因亞型,引物序列見(jiàn)表1 和表2,引物由上海生物工程有限公司合成。將50μL 血清加入到50μL 裂解液中,混勻,99℃水浴 10min,13000rpm 離心 10min,取上清液作為第1 次PCR 反應(yīng)的模板。采用基因型特異性多對(duì)引物巢式PCR 法檢測(cè)HBV 基因型。第1 次PCR 以HBV DNA 為模板,反應(yīng)參數(shù)為:95℃ 10min 預(yù)變性,94℃20s,55℃ 20s,72℃ 30s,40 個(gè)循環(huán),再 72℃ 7min;第 2次PCR 分2 組進(jìn)行,先按表1 分成A 組(包括A、B、C基因型)和B 組(包括D、E、F 基因型)加引物,再分別加入第 1 次 PCR 產(chǎn)物 2μL,PCR 反應(yīng)參數(shù)為:95℃ 10min預(yù)變性,以 94℃ 20s,58℃ 20s,72℃ 30s,進(jìn)行 20 個(gè)循環(huán)之后,再以 94℃ 20s,60℃ 20s,72℃ 30s,進(jìn)行 20 個(gè)循環(huán)。分別取A 組和B 組擴(kuò)增產(chǎn)物4μL 于60g/L 聚丙烯酰胺凝膠上電泳、EB 染色、觀察。

        表1 巢式PCR檢測(cè)HBV基因型特異性引物序列

        表2 檢測(cè)HBV B、C 基因亞型的引物序列

        采用亞型特異性引物半巢式PCR 法檢測(cè)B 基因亞型。第 1 次 PCR 引物為 BAHBF 和 HBAS-4V 或BJHBF 和 HBAS-4V,以 HBV DNA 為模板,反應(yīng)參數(shù)為:95℃ 5min 預(yù)變性,94℃ 20s,55℃ 45s,72℃ 45s,40 個(gè)循環(huán),72℃ 7min 延伸。取第1 次PCR 產(chǎn)物作為第2 次PCR 反應(yīng)的模板,引物為BAHBF 和BJA-RV或BJHBF 和BJA-RV,反應(yīng)參數(shù)為:95℃ 5min 預(yù)變性,94℃ 20s,55℃ 30s,72℃ 30s,40 個(gè)循環(huán),72℃7min 延伸。取第 2 次 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 10μL 于 60g/L 聚丙烯酰胺凝膠上電泳、EB 染色、觀察,出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物即可判斷為其中一個(gè)基因亞型。采用多對(duì)引物PCR法檢測(cè)C 基因亞型。引物為HBVC1R、HBVC2R 和HBVC,以HBV DNA 作為模板,反應(yīng)參數(shù)為:95℃5min 預(yù)變性,94℃ 20s,55℃ 30s,72℃ 30s,40 個(gè)循環(huán),72℃ 7min 延伸。取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物10μL 于60g/L聚丙烯酰胺凝膠上電泳、染色、觀察。

        四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行x2檢驗(yàn)和方差分析,以P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        一、HBV 基因型和基因亞型情況 以特異性條帶分型,B 基因型為 281bp,C 基因型為 122bp。本組未觀察到A、E、F 基因型的特異性條帶;Ba 和Bj 亞型均為110bp,C1 亞型為 340bp,C2 亞型為 240bp。在 660 份HBV DNA 陽(yáng)性血清中,C 基因型為 492 例(74.54%),B 基因型為 110 例(16.67%),B 基因型和 C 基因型混合感染者 58 例(8.79%,表3);在 492 例 C 基因型病例中,C1 亞型為 6 例(1.22%),C2 亞型為 473 例(96.14%),C1/C2 混合亞型 13 例(2.64%)。在 110 例 B 基因型病例中,均為Ba 亞型。

        表3 不同地區(qū)HBV 基因型的分布

        二、HBeAg 陽(yáng)性和陰性慢性乙型肝炎患者HBV基因型和亞型的感染情況 在HBeAg 陽(yáng)性組和陰性組 B 型、C 型、B/C 混合型的病例數(shù)分別為 72、340、33例和38、152、25 例,兩組間基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=3.754,P=0.153)。72 例 HBeAg 陽(yáng)性的 B 基因型慢性乙型肝炎患者均為Ba 亞型;38 例HBeAg 陰性的B 基因型慢性乙型肝炎患者亦為Ba 亞型。在340例HBeAg 陽(yáng)性的C 基因型慢性乙型肝炎患者中,3 例(0.88%)為 C1 亞型,325 例(95.59%)為 C2 亞型,12例(3.53%)為C1 和C2 亞型混合感染;在 152 例HBeAg 陰性的C 基因型慢性乙型肝炎患者中,3 例(1.97%)為 C1 亞型,148 例(97.37%)為 C2 亞型,1 例(0.66%)為C1 和C2 亞型混合感染。在33 例HBeAg 陽(yáng)性的B 基因型和C 基因型混合感染的慢性乙型肝炎患者為Ba 和C2 亞型混合感染;在25 例HBeAg 陰性的B 基因型和C 基因型慢性乙型肝炎患者為Ba 和C2 亞型混合感染。

        三、不同HBV 基因型感染者血清HBV DNA 水平比較 在660 例慢性乙型肝炎患者中,B 基因型和C 基因型患者血清HBV DNA 水平分別為6.29±1.76 lg copies/ml 和 6.37±1.62 lg copies/ml,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但都高于B、C 基因型混合感染患者(5.25±1.65 lg copies/ml),其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        討 論

        隨著HBV 基因分型方法的建立和完善,大量的研究認(rèn)為HBV 基因型與慢性乙型肝炎臨床表現(xiàn)有關(guān)。近年來(lái),在HBV 基因型研究的基礎(chǔ)上,學(xué)者們又進(jìn)行了基因亞型的研究。關(guān)于基因亞型感染的臨床意義,在B 亞型較為明確,即Ba 亞型感染者的平均年齡小于Bj 亞型,HBeAg 陽(yáng)性率高于Bj 亞型,但在無(wú)癥狀HBsAg 攜帶者、慢性乙型肝炎、肝硬化中所占比例以及兩者轉(zhuǎn)氨酶水平均無(wú)顯著性差異[7]。有關(guān)不同C 基因亞型感染的臨床差異,目前尚不清楚。

        本研究表明我國(guó)HBV 基因型以B 基因型和C 基因型為主,其中北方地區(qū)C 基因型居多,南方地區(qū)B基因型為主,有部分B 基因型和C 基因型混合感染。HBV 基因型與病毒復(fù)制水平及病毒標(biāo)志物的表達(dá)有一定的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn),B 基因型感染者抗-HBe 陽(yáng)性率比C 基因型高,而HBV DNA 水平在B 基因型和C 基因型之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8,9]。但有文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為,HBeAg 和抗-HBe 與HBV 基因型之間無(wú)相關(guān)性[10]。本研究結(jié)果顯示,不同HBV 基因型感染患者HBeAg 陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而血清HBV DNA水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,B 基因型和C 基因型患者之間血清HBV DNA 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但均高于B 和C 基因型混合感染患者。不同HBV 基因型感染者的臨床表現(xiàn)可能因HBV 基因型分布的地域、標(biāo)本量和研究手段的不同而還難找出區(qū)別。

        根據(jù)同一基因型內(nèi)序列間的差異>4%且<8%的原則,C 基因型目前可被分為4 個(gè)亞型。最近香港一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),該地區(qū)流行的C 基因型主要為C1 亞型,占80%,其余為C2 亞型,未發(fā)現(xiàn)其他亞型[11]。目前關(guān)于中國(guó)大陸地區(qū)HBV 基因亞型的研究較少。肖蕾等研究顯示廣東地區(qū)流行的HBV 基因亞型以Ba 和C1 亞型為主,C2 亞型較少,Bj 亞型極為罕見(jiàn)[12]。本研究表明我國(guó)這些地區(qū)HBV 基因亞型主要為Ba 和C2 亞型為主,與趙鴻等的研究結(jié)果相符[13]。

        目前 B3、B4 和 C3、C4 亞型只能依靠序列測(cè)定分析法來(lái)檢測(cè),不能用特異性引物PCR法檢測(cè)。本研究采用的PCR 法只能檢測(cè)Ba、Bj、C1 和C2 亞型,不能分出其他的亞型。因此,本研究方法還需要進(jìn)一步完善。

        [1]SUGAUCHI F,KUMADA H,ACHARYA SA,et al.Epidemiological and sequence differences between two subtypes(Ae and Aa)of hepatitis B virus genotype A[J].J Gen Virol,2004,85(Pt4):811-820.

        [2]SUGAUCHI F,ORITO E,ICHIDA T,et al.Hepatitis B virus of genotype B with or without recombination with genotype cover the precore region plus the core gene[J].J Virol,2002,76(12):5985-5992.

        [3]TANAKA Y,ORITO E,YUEN MF,et al.Two subtypes(subgenotypes)of hepatitis B virus genotype C:A novel subtyping assay based on restriction fragment length polymorphism[J].Hepatol Res,2005,33(3):216-224.

        [4]WANG Z,LIU Z,ZENG G,et al.A new intertype recombinant between genotypes C and D of hepatitis B virus identified in China [J].J Gen Virol,2005(Pt4),86:985-990.

        [5]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南[J].實(shí)用肝臟病雜志,2006,9:8-18.

        [6]NAITO H,HAYASHI S,ABE K.Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers[J].J Clin Microbiol,2001,39(1):362-364

        [7]SUGAUCHI F,KUMADA H,SAKUGAWA H,et al.Two subtypes of genotype B (Ba and Bj)of hepatitis B virus in Japan [J].Clin Infect Dis,2004,38 (9):1222-1228.

        [8]NI YH,CHANG MH,HSU HY,et al.Longitudinal study on mutation profiles of core promoter and precore regions of the hepatitis B virus genome in children[J].Pediatr Res,2004,56(3):396-399.

        [9]AKUTA N,SUZUKI F,KOBAYASHI M,et al.The influence of hepatitis B virus genotype on the development of lamivudine resistance during long-term treatment[J].J Hepatol,2003,38(3):315-321.

        [10]LIM CK,TAN JT,KHOO JB,et al.Correlations of HBV genotypes,mutations affecting HBeAg expression and HBeAg/anti-HBe status in HBV carriers [J].Int J Med Sci,2006,3(1):14-20.

        [11]CHAN HLY,TSUI SKW,TSE CH,et al.Epidemiological and virological characteristics of 2 subgroups of hepatitis B virus genotype C [J].J Infect Dis,2005,191(12):2022-2032.

        [12]肖蕾,王雪剛,曾國(guó)兵,等.中國(guó)廣東地區(qū)乙型肝炎病毒基因亞型的分布[J].肝臟,2006,11(3):149-151.

        [13]趙鴻,李俊,李興豐,等.感染乙型肝炎病毒不同基因型和亞型患者的臨床特點(diǎn)分析 [J].中華流行病學(xué)雜志,2007,28(1):74-77.

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