殷繼明 金榮華 嚴(yán) 艷 孫煥琴 于洪波 王 鋒 孫殿興 馮常煒 魏少峰 李 卓

根據(jù)乙型肝炎病毒（HBV）全基因組序列異質(zhì)性≥8%或S 基因序列≥4%，已將HBV 分為A～H 8個(gè)基因型。不同基因型又可進(jìn)一步分為不同亞型，現(xiàn)有研究表明，我國(guó)流行的HBV 基因型主要為B 基因型和C 基因型，其中北方以C 型為主，南方以B 型為主。不同基因亞型在我國(guó)的流行情況如何，是否與臨床疾病進(jìn)展有關(guān)還需要進(jìn)一步探討。本研究應(yīng)用基因型和基因亞型特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增HBV DNA，根據(jù)擴(kuò)增片斷的大小判斷HBV 基因型和基因亞型，對(duì)我國(guó)部分城市660 份慢性乙型肝炎患者血清進(jìn)行了HBV 基因型和基因亞型檢測(cè)。

材料與方法

一、血清標(biāo)本 采集660 例慢性乙型肝炎患者血清，其中北京474 例、長(zhǎng)春55 例、大連20 例、西安26例、石家莊40 例、鄭州33 例、合肥12 例。全部血清標(biāo)本均為HBV DNA 陽(yáng)性。臨床診斷參照2005年慢性乙型肝炎防治指南的標(biāo)準(zhǔn)[5]。

二、血清學(xué)檢測(cè) 采用ELISA 法檢測(cè)乙型肝炎血清標(biāo)記物（北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司）；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)血清HBV DNA（杭州博賽基因診斷技術(shù)有限公司）。

三、HBV DNA 基因型和基因亞型的檢測(cè) Taq DNA 聚合酶、dNTPs 及 DNA Marker 購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心。參照文獻(xiàn)[6，7]并結(jié)合我國(guó)已經(jīng)發(fā)表的B和C 基因型的序列設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)HBV 基因型和基因亞型，引物序列見(jiàn)表1 和表2，引物由上海生物工程有限公司合成。將50μL 血清加入到50μL 裂解液中，混勻，99℃水浴 10min，13000rpm 離心 10min，取上清液作為第1 次PCR 反應(yīng)的模板。采用基因型特異性多對(duì)引物巢式PCR 法檢測(cè)HBV 基因型。第1 次PCR 以HBV DNA 為模板，反應(yīng)參數(shù)為：95℃ 10min 預(yù)變性，94℃20s，55℃ 20s，72℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)，再 72℃ 7min；第 2次PCR 分2 組進(jìn)行，先按表1 分成A 組（包括A、B、C基因型）和B 組（包括D、E、F 基因型）加引物，再分別加入第 1 次 PCR 產(chǎn)物 2μL，PCR 反應(yīng)參數(shù)為：95℃ 10min預(yù)變性，以 94℃ 20s，58℃ 20s，72℃ 30s，進(jìn)行 20 個(gè)循環(huán)之后，再以 94℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 30s，進(jìn)行 20 個(gè)循環(huán)。分別取A 組和B 組擴(kuò)增產(chǎn)物4μL 于60g/L 聚丙烯酰胺凝膠上電泳、EB 染色、觀察。

表1 巢式PCR檢測(cè)HBV基因型特異性引物序列

表2 檢測(cè)HBV B、C 基因亞型的引物序列

采用亞型特異性引物半巢式PCR 法檢測(cè)B 基因亞型。第 1 次 PCR 引物為 BAHBF 和 HBAS-4V 或BJHBF 和 HBAS-4V，以 HBV DNA 為模板，反應(yīng)參數(shù)為：95℃ 5min 預(yù)變性，94℃ 20s，55℃ 45s，72℃ 45s，40 個(gè)循環(huán)，72℃ 7min 延伸。取第1 次PCR 產(chǎn)物作為第2 次PCR 反應(yīng)的模板，引物為BAHBF 和BJA-RV或BJHBF 和BJA-RV，反應(yīng)參數(shù)為：95℃ 5min 預(yù)變性，94℃ 20s，55℃ 30s，72℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)，72℃7min 延伸。取第 2 次 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 10μL 于 60g/L 聚丙烯酰胺凝膠上電泳、EB 染色、觀察，出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物即可判斷為其中一個(gè)基因亞型。采用多對(duì)引物PCR法檢測(cè)C 基因亞型。引物為HBVC1R、HBVC2R 和HBVC，以HBV DNA 作為模板，反應(yīng)參數(shù)為：95℃5min 預(yù)變性，94℃ 20s，55℃ 30s，72℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)，72℃ 7min 延伸。取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物10μL 于60g/L聚丙烯酰胺凝膠上電泳、染色、觀察。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行x2檢驗(yàn)和方差分析，以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HBV 基因型和基因亞型情況 以特異性條帶分型，B 基因型為 281bp，C 基因型為 122bp。本組未觀察到A、E、F 基因型的特異性條帶；Ba 和Bj 亞型均為110bp，C1 亞型為 340bp，C2 亞型為 240bp。在 660 份HBV DNA 陽(yáng)性血清中，C 基因型為 492 例（74.54%），B 基因型為 110 例（16.67%），B 基因型和 C 基因型混合感染者 58 例（8.79%，表3）；在 492 例 C 基因型病例中，C1 亞型為 6 例（1.22%），C2 亞型為 473 例（96.14%），C1/C2 混合亞型 13 例（2.64%）。在 110 例 B 基因型病例中，均為Ba 亞型。

表3 不同地區(qū)HBV 基因型的分布

二、HBeAg 陽(yáng)性和陰性慢性乙型肝炎患者HBV基因型和亞型的感染情況 在HBeAg 陽(yáng)性組和陰性組 B 型、C 型、B/C 混合型的病例數(shù)分別為 72、340、33例和38、152、25 例，兩組間基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=3.754，P=0.153）。72 例 HBeAg 陽(yáng)性的 B 基因型慢性乙型肝炎患者均為Ba 亞型；38 例HBeAg 陰性的B 基因型慢性乙型肝炎患者亦為Ba 亞型。在340例HBeAg 陽(yáng)性的C 基因型慢性乙型肝炎患者中，3 例（0.88%）為 C1 亞型，325 例（95.59%）為 C2 亞型，12例（3.53%）為C1 和C2 亞型混合感染；在 152 例HBeAg 陰性的C 基因型慢性乙型肝炎患者中，3 例（1.97%）為 C1 亞型，148 例（97.37%）為 C2 亞型，1 例（0.66%）為C1 和C2 亞型混合感染。在33 例HBeAg 陽(yáng)性的B 基因型和C 基因型混合感染的慢性乙型肝炎患者為Ba 和C2 亞型混合感染；在25 例HBeAg 陰性的B 基因型和C 基因型慢性乙型肝炎患者為Ba 和C2 亞型混合感染。

三、不同HBV 基因型感染者血清HBV DNA 水平比較 在660 例慢性乙型肝炎患者中，B 基因型和C 基因型患者血清HBV DNA 水平分別為6.29±1.76 lg copies/ml 和 6.37±1.62 lg copies/ml，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但都高于B、C 基因型混合感染患者（5.25±1.65 lg copies/ml），其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

討 論

隨著HBV 基因分型方法的建立和完善，大量的研究認(rèn)為HBV 基因型與慢性乙型肝炎臨床表現(xiàn)有關(guān)。近年來(lái)，在HBV 基因型研究的基礎(chǔ)上，學(xué)者們又進(jìn)行了基因亞型的研究。關(guān)于基因亞型感染的臨床意義，在B 亞型較為明確，即Ba 亞型感染者的平均年齡小于Bj 亞型，HBeAg 陽(yáng)性率高于Bj 亞型，但在無(wú)癥狀HBsAg 攜帶者、慢性乙型肝炎、肝硬化中所占比例以及兩者轉(zhuǎn)氨酶水平均無(wú)顯著性差異[7]。有關(guān)不同C 基因亞型感染的臨床差異，目前尚不清楚。

本研究表明我國(guó)HBV 基因型以B 基因型和C 基因型為主，其中北方地區(qū)C 基因型居多，南方地區(qū)B基因型為主，有部分B 基因型和C 基因型混合感染。HBV 基因型與病毒復(fù)制水平及病毒標(biāo)志物的表達(dá)有一定的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，B 基因型感染者抗-HBe 陽(yáng)性率比C 基因型高，而HBV DNA 水平在B 基因型和C 基因型之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8，9]。但有文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為，HBeAg 和抗-HBe 與HBV 基因型之間無(wú)相關(guān)性[10]。本研究結(jié)果顯示，不同HBV 基因型感染患者HBeAg 陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而血清HBV DNA水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，B 基因型和C 基因型患者之間血清HBV DNA 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均高于B 和C 基因型混合感染患者。不同HBV 基因型感染者的臨床表現(xiàn)可能因HBV 基因型分布的地域、標(biāo)本量和研究手段的不同而還難找出區(qū)別。

根據(jù)同一基因型內(nèi)序列間的差異＞4%且＜8%的原則，C 基因型目前可被分為4 個(gè)亞型。最近香港一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)流行的C 基因型主要為C1 亞型，占80%，其余為C2 亞型，未發(fā)現(xiàn)其他亞型[11]。目前關(guān)于中國(guó)大陸地區(qū)HBV 基因亞型的研究較少。肖蕾等研究顯示廣東地區(qū)流行的HBV 基因亞型以Ba 和C1 亞型為主，C2 亞型較少，Bj 亞型極為罕見(jiàn)[12]。本研究表明我國(guó)這些地區(qū)HBV 基因亞型主要為Ba 和C2 亞型為主，與趙鴻等的研究結(jié)果相符[13]。

目前 B3、B4 和 C3、C4 亞型只能依靠序列測(cè)定分析法來(lái)檢測(cè)，不能用特異性引物PCR法檢測(cè)。本研究采用的PCR 法只能檢測(cè)Ba、Bj、C1 和C2 亞型，不能分出其他的亞型。因此，本研究方法還需要進(jìn)一步完善。

[1]SUGAUCHI F，KUMADA H，ACHARYA SA，et al.Epidemiological and sequence differences between two subtypes（Ae and Aa）of hepatitis B virus genotype A[J].J Gen Virol，2004，85（Pt4）：811-820.

[2]SUGAUCHI F，ORITO E，ICHIDA T，et al.Hepatitis B virus of genotype B with or without recombination with genotype cover the precore region plus the core gene[J].J Virol，2002，76（12）：5985-5992.

[3]TANAKA Y，ORITO E，YUEN MF，et al.Two subtypes（subgenotypes）of hepatitis B virus genotype C：A novel subtyping assay based on restriction fragment length polymorphism[J].Hepatol Res，2005，33（3）：216-224.

[4]WANG Z，LIU Z，ZENG G，et al.A new intertype recombinant between genotypes C and D of hepatitis B virus identified in China [J].J Gen Virol，2005（Pt4），86：985-990.

[5]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南[J].實(shí)用肝臟病雜志，2006，9：8-18.

[6]NAITO H，HAYASHI S，ABE K.Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers[J].J Clin Microbiol，2001，39（1）：362-364

[7]SUGAUCHI F，KUMADA H，SAKUGAWA H，et al.Two subtypes of genotype B （Ba and Bj）of hepatitis B virus in Japan [J].Clin Infect Dis，2004，38 （9）：1222-1228.

[8]NI YH，CHANG MH，HSU HY，et al.Longitudinal study on mutation profiles of core promoter and precore regions of the hepatitis B virus genome in children[J].Pediatr Res，2004，56（3）：396-399.

[9]AKUTA N，SUZUKI F，KOBAYASHI M，et al.The influence of hepatitis B virus genotype on the development of lamivudine resistance during long-term treatment[J].J Hepatol，2003，38（3）：315-321.

[10]LIM CK，TAN JT，KHOO JB，et al.Correlations of HBV genotypes，mutations affecting HBeAg expression and HBeAg/anti-HBe status in HBV carriers [J].Int J Med Sci，2006，3（1）：14-20.

[11]CHAN HLY，TSUI SKW，TSE CH，et al.Epidemiological and virological characteristics of 2 subgroups of hepatitis B virus genotype C [J].J Infect Dis，2005，191（12）：2022-2032.

[12]肖蕾，王雪剛，曾國(guó)兵，等.中國(guó)廣東地區(qū)乙型肝炎病毒基因亞型的分布[J].肝臟，2006，11（3）：149-151.

[13]趙鴻，李俊，李興豐，等.感染乙型肝炎病毒不同基因型和亞型患者的臨床特點(diǎn)分析 [J].中華流行病學(xué)雜志，2007，28（1）：74-77.