大豆肽不僅較大豆蛋白更易于消化吸收，還具有很強的抗氧化、抗衰老、降血壓、減肥等功效，且成本低廉，已成為研究者關(guān)注的熱點之一。動物試驗[1]證明，小分子肽(由2～4個氨基酸組成的寡肽)比蛋白質(zhì)和氨基酸更容易被消化吸收。以往對大豆肽的研究往往只注重大豆蛋白的酶解率，而對小分子肽得率相對忽略，這使得研究結(jié)果很難真正有效。

AS1.398中性蛋白酶是一種優(yōu)質(zhì)的中性蛋白酶，相對于木瓜蛋白酶、胰蛋白酶具有更強的水解能力[2]。

作者在此以小分子肽得率為水解度考察指標，對AS1.398中性蛋白酶的特性進行了研究。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

脫脂大豆粕(經(jīng)凱氏定氮法[3]測其蛋白質(zhì)含量為85.6%),遼寧鑫吉糧油加工公司。

枯草桿菌AS1.398中性蛋白酶(酶活為5萬U·g-1)，無錫雪梅酶制劑科技有限公司。

紫外可見分光光度計，離心分離機，pH酸度計，凱氏定氮儀，增力電動攪拌器，電熱恒溫水浴鍋，恒溫干燥箱，九陽料理機，微量滴定管，電子分析天平等。

1.2 方法

原料 → 打碎 → 過篩 → 調(diào)底物濃度 → 預處理 → 調(diào)溫度→調(diào)pH值 → 加酶→ 水解 → 滅酶。

1.3 水解度(以小分子肽得率計)測定

水解度(DH)測定依據(jù)pH-stat法[4]。

2 結(jié)果與討論

2.1 加酶量對水解度的影響(圖1)

圖1 加酶量對水解度的影響

由圖1可知，水解度隨著加酶量的增加而上升；當加酶量達到12 000 U·g-1后，上升趨緩。這是因為底物濃度一定時，底物的轉(zhuǎn)化率取決于酶的量，酶分子越多，與蛋白質(zhì)分子肽鏈的接觸幾率越大，則底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物肽也就相應增多，水解度升高；但當加酶量比較高時，底物的相對濃度較小，已經(jīng)被酶飽和，有一部分酶分子將不能與大豆蛋白質(zhì)分子結(jié)合，導致水解度上升趨緩。綜合考慮，確定適宜的加酶量為16 000 U·g-1。

2.2 底物濃度對水解度的影響(圖2)

從圖2可以看出，大豆蛋白的濃度對水解度影響不大。 當?shù)孜餄舛容^低時，酶與底物結(jié)合幾率較小，反應速度較慢，導致水解度較低；適當增加底物濃度有利于反應速度的加快，相應水解度升高；但底物濃度達6%以后， 隨著底物濃度的進一步增加，水解度反而下降。因此，確定適宜的大豆蛋白濃度為6%。

圖2 底物濃度對水解度的影響

2.3 溫度對水解度的影響(圖3)

圖3 溫度對水解度的影響

從圖3可以看出， 溫度對AS1.398中性蛋白酶水解大豆蛋白的影響十分顯著。水解度隨溫度的升高先上升而后下降，45℃時的水解度最高。這是因為，較低溫度下，酶活力相對較低，大豆蛋白水解度低；較高溫度下，蛋白酶迅速失活，導致酶解反應停滯。因此，確定適宜的溫度為45℃。

2.4 pH值對水解度的影響(圖4)

圖4 pH值對水解度的影響

從圖4可以看出，AS1.398蛋白酶在微堿性條件下水解大豆蛋白的效果最好。因此，選擇適宜的pH值為7.5。

2.5 水解時間對水解度的影響(圖5)

圖5 水解時間對水解度的影響

從圖5可以看出，水解度隨水解時間的延長呈上升趨勢，尤其在最初的2 h內(nèi)升幅顯著，之后上升趨緩。這是因為蛋白酶具有專一性，隨著水解時間延長，蛋白酶可水解的肽鍵逐漸減少，同時蛋白酶活力以半衰期方式下降。但考慮原料利用的問題，選擇適宜的水解時間為3 h。

2.6 酶水解最佳工藝條件的確定

通過單因素實驗，選擇加酶量、溫度、底物濃度、pH值為考察因素，以水解度為考察指標，水解時間為3 h，進行L9(43)正交實驗，以確定大豆蛋白的最佳酶解條件。正交實驗因素與水平見表1，結(jié)果與分析見表2。

表1 正交實驗因素與水平

從表2可以看出，各因素對水解度影響大小依次為溫度>加酶量>底物濃度>pH值。酶水解的最佳工藝參數(shù)為A3B2C2D2，即：加酶量17 000 U·g-1、溫度45℃、底物濃度6%、pH值7.5。

2.7 不同時間段酶解產(chǎn)物的活性鑒定與比較

以0.01%的維生素作為對照,采用羥基自由基體系研究不同時間段大豆肽液的抗氧化性質(zhì),結(jié)果見表3。

表2 正交實驗結(jié)果與分析

表3 不同時間段所得大豆肽清除自由基能力

從表3可以看出,在一定時間內(nèi)水解物清除自由基能力隨著水解度的增加而增強，但隨著水解時間的延長，水解度增大，清除自由基能力卻下降。大豆蛋白水解度反映的是大豆蛋白肽鍵的斷裂情況以及大豆肽平均分子量的變化，對酶解物的抗氧化活性有很大影響。水解度太小時，肽段過長，具有抗氧化性的一些氨基酸未能斷裂而呈現(xiàn)在肽段的N-末端和C-末端，抗氧化性無法顯示;隨著水解度的增加，大豆蛋白逐漸解聚，原來包埋于分子內(nèi)部的抗氧化氨基酸殘基顯露出來，發(fā)揮抗氧化作用；隨著水解的深入，大豆肽的肽鏈長度逐漸縮短，由疏水性氨基酸殘基組成的肽鏈逐漸展開，有助于插入脂質(zhì)內(nèi)部，從而使抗氧化氨基酸殘基更易于發(fā)揮抗氧化作用；但隨著水解時間的繼續(xù)延長，水解度進一步增大，當水解度太大時，游離氨基酸的含量過高，酶解物的抗氧化性轉(zhuǎn)而下降。

3 結(jié)論

(1)采用枯草桿菌AS1.398中性蛋白酶對大豆粕蛋白進行酶水解，通過單因素實驗及正交實驗，確定了單酶法制備大豆低分子肽的最優(yōu)工藝條件如下：溫度45℃、pH值7.5、加酶量17 000 U·g-1、底物濃度6%、水解時間3 h。

(2)采用羥基自由基體系測定酶解不同時間段所得大豆肽液的抗氧化活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定時間范圍內(nèi)，隨著水解時間的延長，水解度逐漸增大，酶解物的抗氧化活性增強；隨著水解時間的繼續(xù)延長，水解度進一步增大，酶解物的抗氧化活性反而下降。其中抗氧化活性最強的為水解2.5 h的大豆肽液。

參考文獻：

[1] 豆康寧,董彬,王銀滿.大豆蛋白活性肽的生物功能與應用前景[J].糧食加工,2007,32(2):52-54.

[2] 葛文光.大豆多肽的生理功能及作用效果[J].無錫輕工大學學報，1996，15(3):272-277.

[3] 李建武．生物化學實驗原理和方法[M]．北京：北京大學出版社，1997：160-164．

[4] 姚玉靜，崔春，邱禮平，等.pH-stat法和甲醛滴定法測定大豆蛋白水解度準確性比較[J].食品工業(yè)科技，2008，(9)：268-270.