腈水合酶是以硫原子和半胱氨酸——亞磺酸殘基為絕對中心的能催化腈類化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺類化合物的同工酶[1,2]。不同菌株所產(chǎn)腈水合酶在結(jié)構(gòu)和特性上存在較大差異。目前已知能產(chǎn)腈水合酶的微生物有紅球菌(Rhodococcus)、假單胞菌(Pseudomonas)、假諾卡氏菌(Pseudoncardia)、節(jié)桿菌(Arthobacter)、芽孢桿菌(Bacillus)、諾卡氏菌(Nocardia)、叢毛單胞菌(Comamonas)、棒狀桿菌(Corynebaterium)及短桿菌(Brevibacterium)[3]。腈水合酶生產(chǎn)菌株最初主要是利用其產(chǎn)生的腈水解酶處理含腈污水，經(jīng)過誘變培養(yǎng)后，菌株以產(chǎn)腈水合酶為主，用來催化腈類物質(zhì)與水發(fā)生加成反應(yīng)生成酰胺類物質(zhì)(如丙烯酰胺)。目前國內(nèi)利用生物法生產(chǎn)丙烯酰胺的企業(yè)已超過10家，每年總產(chǎn)量超過20萬t,還有許多公司計劃擴(kuò)建生產(chǎn)裝置[4～7]。

腈水合酶催化丙烯腈水合反應(yīng)技術(shù)是生物法生產(chǎn)丙烯酰胺的核心技術(shù)。由于菌株在產(chǎn)腈水合酶的同時也產(chǎn)生一定的腈水解酶，其催化反應(yīng)過程中，不僅催化丙烯腈與水反應(yīng)生成丙烯酰胺，還催化丙烯酰胺與水發(fā)生水解反應(yīng)生成丙烯酸。反應(yīng)如下：

催化反應(yīng)過程生成的反應(yīng)液由于電導(dǎo)率高而難于精制，不僅耗水量大、廢水多、產(chǎn)率低，而且使離子樹脂精制塔再生頻繁，大大增加了生產(chǎn)成本、嚴(yán)重影響了產(chǎn)品質(zhì)量。為此，作者對腈水合酶催化反應(yīng)液電導(dǎo)率的控制進(jìn)行了研究。

1 實驗

1.1 菌種

諾卡氏菌(Nocardia)。

1.2 氣相色譜分析條件

柱箱溫度190℃，運(yùn)行時間6 min；進(jìn)樣口模式為分流，分流比40∶1，加熱器溫度200℃，壓力110.5 kPa，載氣為氮?dú)?，總流?7.7 mL·min-1，分流流量73.2 mL·min-1；色譜柱：毛細(xì)管柱，Agilent Q 10.0 m×320 μm×20.0 μm，最高柱溫270℃，模式為恒定壓力，壓力110.5 kPa，額定初始流量1.8 mL·min-1，平均速率59 cm·min-1，出口壓力為環(huán)境壓力；檢測器：氫火焰離子檢測器，溫度250℃，模式為恒定柱流加尾吹，氫氣流量30.0 mL·min-1，空氣流量300.0 mL·min-1，合并流量30.0 mL·min-1；進(jìn)樣針：注射器尺寸5.0 μL，進(jìn)樣體積1.0 μL。

1.3 分析方法

采用外標(biāo)分析法(進(jìn)樣量1.0 μL)檢測丙烯酸含量；采用EF30K型電導(dǎo)率儀(梅特勒公司)測定電導(dǎo)率。

2 結(jié)果與討論

2.1 影響腈水合酶催化丙烯腈反應(yīng)液電導(dǎo)率的因素

研究發(fā)現(xiàn)，影響反應(yīng)液電導(dǎo)率的因素主要有加入菌體帶入的無機(jī)鹽和菌體的代謝產(chǎn)物、催化反應(yīng)過程中由于菌體死亡發(fā)生自溶產(chǎn)生的氨基酸等有機(jī)類物質(zhì)、菌體細(xì)胞中含有的腈水解酶。

在工業(yè)生產(chǎn)過程中，當(dāng)加入規(guī)定量的發(fā)酵液離心后的菌體后，測定游離細(xì)胞液的電導(dǎo)率為176 μS·cm-1，催化反應(yīng)結(jié)束后測定反應(yīng)液的電導(dǎo)率為1102 μS·cm-1，反應(yīng)液中丙烯酸的含量為1429×10-6。為考察丙烯酸含量對反應(yīng)液電導(dǎo)率的影響，用脫鹽水配制不同含量的丙烯酸溶液，并測定相應(yīng)溶液的電導(dǎo)率，結(jié)果見表1。

表1 丙烯酸水溶液電導(dǎo)率

各因素在腈水合酶催化反應(yīng)中對反應(yīng)液電導(dǎo)率影響大小分別為：

(1)加入菌體帶入的無機(jī)鹽和菌體的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的電導(dǎo)率所占比例為：

176/1102 =16%

(2)生成丙烯酸產(chǎn)生的電導(dǎo)率所占比例為：

[325+(402-325)×(1429-800)/(1200-800)]/1102 = 41%

(3)菌體死亡發(fā)生自溶產(chǎn)生的氨基酸等有機(jī)類物質(zhì)產(chǎn)生的電導(dǎo)率所占比例為：

100%-41%-16% = 43%

因此，當(dāng)腈水合酶催化反應(yīng)條件確定后，若要降低反應(yīng)液電導(dǎo)率，應(yīng)減少腈水合酶催化反應(yīng)過程中丙烯酸的生成，即降低腈水合酶生產(chǎn)菌株的產(chǎn)腈水解酶的能力，篩選低產(chǎn)丙烯酸的腈水合酶生產(chǎn)菌株。

2.2 低產(chǎn)丙烯酸腈水合酶生產(chǎn)菌株的篩選

在實際生產(chǎn)過程中，通常按照單菌落的形態(tài)選擇菌株，光滑型的菌落產(chǎn)生腈水解酶的量少，反應(yīng)液的電導(dǎo)率可由4112 μS·cm-1降低到2725 μS·cm-1[8]。研究發(fā)現(xiàn)，丁烯酰胺對腈水合酶生產(chǎn)菌株具有定向選擇作用，當(dāng)固態(tài)平板培養(yǎng)基中丁烯酰胺的含量在1%

左右時，多產(chǎn)腈水解酶的菌株能夠存活，而少產(chǎn)腈水解酶的菌株不能存活。利用這一規(guī)律進(jìn)行定向篩選，從而獲得低產(chǎn)丙烯酸的產(chǎn)腈水合酶菌株，將其用于催化丙烯腈水合反應(yīng)，測試反應(yīng)液電導(dǎo)率，結(jié)果見表2。

表2 定向選擇菌株對反應(yīng)液電導(dǎo)率的影響

由表2可知，定向篩選的低產(chǎn)丙烯酸腈水合酶生產(chǎn)菌株能明顯降低反應(yīng)液的電導(dǎo)率。

3 結(jié)論

利用含1%丁烯酰胺的培養(yǎng)基對生產(chǎn)菌株進(jìn)行定向選擇，可以獲得低產(chǎn)丙烯酸菌株，該類菌株主要產(chǎn)腈水合酶，而產(chǎn)腈水解酶的能力相對低得多。將低產(chǎn)腈水解酶的生產(chǎn)菌株發(fā)酵制得的生物催化劑用于催化丙烯腈水合反應(yīng)，能顯著降低丙烯酸產(chǎn)量，控制反應(yīng)液的電導(dǎo)率在500 μS·cm-1以下。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉銘，李春，黃星，等.Nocardiasp.腈水合酶的純化過程研究[J].高?；瘜W(xué)工程學(xué)報，2004，18(3)：324-328.

[2] 鄧林，劉延嶺，王忠彥，等.產(chǎn)腈水合酶菌株的馴化選育及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005,31(1):53-56.

[3] 劉銘，焦鵬，曹竹安.微生物法生產(chǎn)丙烯酰胺的生物催化劑——腈水合酶研究進(jìn)展[J].化工學(xué)報，2001，52(10)：847-851.

[4] 羅積杏，薛建萍，沈寅初.我國生物法生產(chǎn)丙烯酰胺的現(xiàn)狀及研發(fā)概況[J].上?；ぃ?007，32(2)：17-21.

[5] 馬武生，馬同森，楊生玉.腈水合酶及其在丙烯酰胺生產(chǎn)中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].化學(xué)研究，2004，15(1)：75-79.

[6] 高毅，劉銘，曹竹安.生物法生產(chǎn)丙烯酰胺過程中腈水合酶的抑制和失活[J].過程工程學(xué)報，2005，5(2)：193-196.

[7] 婁文勇，宗敏華，劉森林.微生物酶催化腈水解反應(yīng)的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)報，2001，28(6)：77-81.

[8] 阮繼紅，陳瑤，盛建軍，等.丙烯腈水合酶產(chǎn)生菌光滑型菌落對丙烯酰胺生產(chǎn)的影響[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，24(2)：288-292.