研究表明，環(huán)境因素是導(dǎo)致人類腫瘤的重要誘因之一。隨著科學(xué)的發(fā)展與社會的進(jìn)步,越來越多的化合物進(jìn)入了人類的生產(chǎn)和生活環(huán)境。外源小分子與蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子相互作用的研究涉及許多相關(guān)學(xué)科，如生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物化學(xué)、物理學(xué)及計算化學(xué)等，一直是相關(guān)交叉領(lǐng)域的研究熱點。一般而言，外源小分子與生物大分子的靶部位作用后，將使后者發(fā)生變化，繼而引起一系列生物體內(nèi)的物理變化或化學(xué)變化，最終體現(xiàn)為效應(yīng)。血清白蛋白、DNA與小分子間的超分子作用，因其在藥物設(shè)計與合成及藥物作用機理研究等方面的重要意義，引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。作者在此對環(huán)境污染物與生物大分子相互作用的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，重點介紹了光譜法研究進(jìn)展。

1 環(huán)境污染物與DNA相互作用的研究現(xiàn)狀

靶向分子與DNA結(jié)合的部位是DNA的堿基、磷酸骨架和戊糖環(huán)，即DNA由平行的堿基、聚陰離子磷酸骨架以及大溝和小溝組成了靶向分子識別的位點。非共價鍵結(jié)合主要包括靜電、溝區(qū)、插入等幾種作用方式。

早在20世紀(jì)60年代，人們就發(fā)現(xiàn)蒽環(huán)化合物的蒽環(huán)平面可以嵌入DNA而形成加合物。一些致癌物也能與DNA形成加合物，這種DNA加合物都是由DNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程產(chǎn)生的，也是可能癌變的預(yù)警標(biāo)志物質(zhì)。因此，環(huán)境化學(xué)污染物與DNA相互作用的研究對于揭示某些基因突變的原因、尋找快速測定基因突變的方法以及相應(yīng)的基因治療藥物具有重要意義。目前，國內(nèi)外在此領(lǐng)域研究報道尚不多，環(huán)境污染物與DNA相互作用研究總結(jié)見表1。

表1 環(huán)境污染物與DNA的相互作用

環(huán)境化學(xué)物質(zhì)有機磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥[1～7](如馬拉硫磷、甲萘威、毒死蜱、氰戊菊酯)以及環(huán)境污染物蒽[8]等與DNA的作用已見諸報道。任麗萍等[9]發(fā)現(xiàn)阿特拉津-ctDNA在319.8 nm處有一增強的共振光散射光譜峰，且共振光散射強度與ctDNA的濃度呈線性關(guān)系，據(jù)此建立了測定痕量DNA的方法。段云青等[19]研究了抗凝殺鼠劑溴鼠靈與小牛胸腺DNA的相互作用。這些研究表明，小分子化合物與DNA的結(jié)合模式主要是通過靜電、溝區(qū)、插入等非共價鍵方式結(jié)合，如氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水作用等。雖然這些均屬于弱作用鍵，但在分子水平的生命現(xiàn)象中卻是決定性的因素。

2 環(huán)境污染物與蛋白質(zhì)相互作用的研究現(xiàn)狀

血清白蛋白(Serum albumin，SA)是人和動物體內(nèi)血液中含量最豐富的蛋白質(zhì)，容易較大量、高純度地制備。同其它蛋白質(zhì)比較，SA分子量較小、溶解性較大、穩(wěn)定性較好、帶有凈負(fù)電荷，且能與體內(nèi)許多內(nèi)源性物質(zhì)及許多外源小分子配體相互結(jié)合，因而成為研究蛋白質(zhì)在體內(nèi)代謝、生物學(xué)功能、臨床應(yīng)用及遺傳變異等方面的理想蛋白質(zhì)，也是此類研究中應(yīng)用最為廣泛的蛋白質(zhì)。環(huán)境污染物進(jìn)入人體后，先與SA結(jié)合，然后被轉(zhuǎn)運到其它組織部位釋放出來，產(chǎn)生危害作用。近年來，國內(nèi)外學(xué)者主要集中于研究污染物的宏觀毒性，關(guān)于其與生物分子特別是典型的生物大分子SA的相互作用則鮮有報道。環(huán)境污染物與血清白蛋白相互作用研究總結(jié)見表2。

表2 環(huán)境污染物與血清白蛋白的相互作用

Purcell等[20]研究了除草劑阿特拉津和2,4-二氯取代的阿特拉津與人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)的相互作用，發(fā)現(xiàn)二者均引起蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，β-折疊以及其它結(jié)構(gòu)增加。百草枯是一種速效觸殺型滅生性除草劑，對人畜毒性較強[21]。顏承農(nóng)等[22]和Zhang等[23]分別采用紫外和熒光方法詳細(xì)研究了百草枯與牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)及HSA的相互作用。王月等[24]模擬環(huán)境中的復(fù)雜體系，通過測定典型有機污染物鄰、間、對硝基苯胺共存時與BSA的相互作用結(jié)合常數(shù)，評價三種硝基苯胺共存時與BSA結(jié)合強度的大小，建立了一種基于分子水平親和作用原理的快速毒性評價方法。

3 外源分子與蛋白質(zhì)或DNA相互作用的光譜研究方法

DNA分子中的堿基和蛋白質(zhì)分子中的色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸等氨基酸殘基都具有特殊的光學(xué)活性。許多外源小分子或本身具有光學(xué)活性，或與SA和DNA大分子結(jié)合后產(chǎn)生光學(xué)活性，因此用光譜方法通過考察SA和DNA大分子結(jié)合小分子后結(jié)構(gòu)上的變化來研究結(jié)合機理，是非常有效和應(yīng)用最廣泛的方法。常用的光譜法包括紫外可見光譜法、熒光光譜法、紅外光譜法和圓二色光譜法等。

3.1 紫外可見光譜法(UV-Vis spectrum)

DNA分子的紫外可見光譜在260 nm左右有最大吸收。許多外源分子與DNA結(jié)合后，DNA或外源分子的吸收光譜都會發(fā)生變化，如引起吸收帶的紅移(藍(lán)移)現(xiàn)象或增色(減色)效應(yīng)，因此，用紫外可見吸收光譜法來研究DNA與外源分子的結(jié)合機理，是非常有效和應(yīng)用廣泛的方法。劉偉等[3]利用吸收光譜法對毒死蜱、氰戊菊酯和馬拉硫磷與DNA作用的研究表明，三者均能引起DNA的紫外譜圖發(fā)生波長位移和減色效應(yīng)，推斷它們可能加合到DNA的親核位點，對DNA造成損傷。孫英等[5]對3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥與ctDNA作用的紫外光譜研究表明，它們能插入DNA的螺旋雙鏈，通過形成DNA加合物的形式導(dǎo)致基因突變，最終對生物體的DNA產(chǎn)生化學(xué)損傷。同樣，一些小分子配體與蛋白質(zhì)結(jié)合后,其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化，相應(yīng)出現(xiàn)了吸收峰位移或譜峰寬度的變化，據(jù)此可研究蛋白質(zhì)與小分子間的結(jié)合強弱和結(jié)合機理。童沈陽等應(yīng)用吸收光譜法對多種染料與蛋白質(zhì)BSA的結(jié)合反應(yīng)機理及結(jié)合參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究[34～36]。

3.2 熒光光譜法(Fluorescence spectrum)

蛋白質(zhì)分子中含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)以及苯丙氨酸(Phe)三種芳香族氨基酸殘基，在紫外光照射下會發(fā)射熒光(圖1)，所以蛋白質(zhì)屬于內(nèi)源性熒光物質(zhì)，可直接根據(jù)作用物對其內(nèi)源熒光的猝滅或加強程度來考察相互作用的機理及結(jié)合強度；熒光測試中的發(fā)射峰特征、能量轉(zhuǎn)移等指標(biāo)可為蛋白質(zhì)分子中熒光生色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)及其所處的微環(huán)境研究提供有用信息；根據(jù)能量轉(zhuǎn)移機理，可以求出結(jié)合于蛋白質(zhì)的外源分子距蛋白質(zhì)中色氨酸的距離;通過外源分子與結(jié)合部位已知的熒光探針競爭蛋白質(zhì)結(jié)合部位，可以確定藥物在蛋白質(zhì)上的結(jié)合部位;利用熒光探針，可以研究蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象。由于熒光探針具有靈敏度高、選擇性強、用樣量少、方法簡便等優(yōu)點，近年來在蛋白質(zhì)分子構(gòu)象研究中得到越來越廣泛的應(yīng)用。Demant[37]研究了BSA與7-羥基香豆素-4-乙酸所形成的共價配合物BSA-HCA的熒光性質(zhì)，并以此化合物為熒光探針建立了定量測定脂肪酸的方法。Yang等[38,39]在發(fā)展蛋白質(zhì)與小分子化合物相互作用的熒光研究法及熒光探針方面做了大量工作。

圖1 血清白蛋白中Trp、Tyr及Phe的熒光光譜

DNA雖無內(nèi)源熒光，但可通過熒光探針法來研究其與熒光體或其它化合物的作用，小分子與DNA的鍵合方式也直接影響著穩(wěn)態(tài)熒光光譜[40,41]。溴化乙錠是應(yīng)用最早的熒光探針，被廣泛應(yīng)用于抗癌藥物的篩選和小分子與DNA作用的研究[41,42]。Zhou等[43]應(yīng)用熒光法研究了胺類化合物與DNA的相互作用模式。通過考察典型熒光猝滅劑如KI和K4Fe(CN)6對小分子熒光的猝滅作用也可以判斷小分子與DNA之間的作用方式。當(dāng)小分子與DNA屬于嵌插作用時，猝滅劑的猝滅作用減弱；而當(dāng)小分子與DNA屬于溝槽作用時，猝滅作用增強。

三維熒光光譜法是近20年來發(fā)展起來的熒光分析新技術(shù)。它不僅可以提高測量的靈敏度和對分子結(jié)構(gòu)的選擇性，而且能夠更加全面地展現(xiàn)樣品的熒光信息，有利于綜合考察樣品的組分分布及構(gòu)型變化特征，能直觀地觀察Trp殘基在蛋白質(zhì)分子的微環(huán)境中以及不同條件下的構(gòu)象變化，有望得到廣泛的應(yīng)用。鄢遠(yuǎn)等[44]將三維熒光光譜法用于測定溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)的構(gòu)象，顏承農(nóng)等[22]研究發(fā)現(xiàn)百草枯存在時，BSA三維光譜峰出現(xiàn)不同程度的降低，大劑量百草枯可對BSA構(gòu)象產(chǎn)生嚴(yán)重影響，從而使BSA失去活性功能。

3.3 熒光偏振技術(shù)(Fluorescence polarization)

偏振是熒光分子按照偏振激發(fā)方向的光取向的結(jié)果。在粘度小的溶劑(如水)中，當(dāng)激發(fā)光位于熒光分子主吸收帶且沒有發(fā)生分子間能量損失時，其偏振度與熒光分子的轉(zhuǎn)動速度有關(guān)，轉(zhuǎn)動速度快，熒光偏振小；反之，轉(zhuǎn)動速度慢，熒光偏振大。對熒光樣品進(jìn)行退偏振觀測可用來確定蛋白質(zhì)的變性作用、蛋白質(zhì)和小分子配體的結(jié)合反應(yīng)以及蛋白質(zhì)的旋轉(zhuǎn)速率等。一般而言，蛋白質(zhì)的偏振度降低，說明離子與蛋白質(zhì)之間發(fā)生了相互結(jié)合作用[45]。小分子與DNA作用后熒光偏振的變化情況也是判斷小分子是否與DNA發(fā)生嵌插作用的一個標(biāo)準(zhǔn)。通常當(dāng)小分子嵌插到堿基中時，其轉(zhuǎn)動受阻，熒光偏振會隨之變大，而非嵌插作用不會引起熒光偏振的增大[46]。

3.4 同步熒光技術(shù)(Synchronization fluorescence spectrum)

同步熒光技術(shù)是在同時掃描激發(fā)和發(fā)射波長的情況下測繪熒光光譜圖，可以提供熒光功能團(tuán)附近微環(huán)境的變化。Miller[47]用同步熒光技術(shù)分別測得蛋白質(zhì)分子中Trp和Tyr的特征光譜，而用普通的熒光光譜就無法獲得。Δλ為15 nm 的同步熒光光譜圖顯示了蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的光譜特征，而Δλ為60 nm 的同步熒光光譜圖僅表現(xiàn)出色氨酸殘基的光譜特征[48～50]。氨基酸殘基的最大熒光波長與其所處環(huán)境的疏水性有關(guān)，如果氨基酸所處環(huán)境的疏水性降低，則其最大發(fā)射波長紅移，所以由熒光波長的改變可判斷蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(構(gòu)象)的變化[51]。周能等[52]研究了蘇丹Ⅰ與BSA的作用，結(jié)果表明，隨蘇丹Ⅰ濃度的增大，Trp和Tyr殘基的同步熒光光譜的最大波長保持不變，說明蘇丹Ⅰ的加入沒有引起B(yǎng)SA的構(gòu)象變化，但蘇丹Ⅰ更易靠近Trp殘基。

3.5 共振 Rayleigh 散射光譜(Resonance Rayleigh scattering，RRS)

共振 Rayleigh 散射光譜也稱瑞利光散射(RLS)，是一類入射光與反射光波長相同的光散射，屬于同步發(fā)光。自從1993年P(guān)asternack等[53]首次用共振光散射技術(shù)對卟啉類化合物在核酸上的聚集進(jìn)行研究之后，揭開了光散射技術(shù)在分析化學(xué)方面應(yīng)用的序幕并使光散射技術(shù)逐步成為儀器分析方面的重要補充。Feng等[54]、劉紹璞[55]利用卟啉、染料等在蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子上聚集組裝時產(chǎn)生的RRS信號與生物大分子濃度之間的線性關(guān)系，建立了RRS測定生物大分子的新分析方法，從而開辟了RRS在分析化學(xué)中的應(yīng)用新領(lǐng)域。馬春琪等[56]指出RRS信號改變可歸結(jié)為兩個原因，即散射體幾何尺寸的變化和散射體電子離域程度的變化。

3.6 圓二色光譜(Circular dichroism，CD)

圓二色光譜以高頻變換的左旋或右旋偏振光作為入射光，為有機化合物的絕對構(gòu)型、構(gòu)象和反應(yīng)機理的研究提供了很多信息。B型DNA 圓二色光譜圖(圖2)中有一強度相當(dāng)?shù)恼搴拓?fù)峰，275 nm處強的正峰是由于DNA的堿基對堆積而產(chǎn)生的，245 nm處的負(fù)峰是由于DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生的[57,58]。因此，當(dāng)外源物質(zhì)加入到DNA中時，根據(jù)DNA圓二色光譜圖峰的變化可以判斷外源小分子對DNA結(jié)構(gòu)的影響。而對一些本身沒有CD信號，但與DNA結(jié)合后能產(chǎn)生誘導(dǎo)CD信號的分子，也可獲得一定的有關(guān)其結(jié)構(gòu)變化的信息。例如，Tuite等[59]研究了亞甲基藍(lán)與DNA作用的誘導(dǎo)CD譜，對亞甲基藍(lán)與不同堿基序列DNA結(jié)合的方式及序列選擇性進(jìn)行了詳細(xì)的比較。Leng等[60]研究了道諾霉素與DNA作用前后產(chǎn)生的誘導(dǎo)CD譜的變化。

圖2 ctDNA的圓二色光譜

蛋白質(zhì)的CD譜一般分為兩個波長范圍：185～245 nm為遠(yuǎn)紫外區(qū)CD譜，245～320 nm為近紫外區(qū)CD譜。不同二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽所產(chǎn)生CD譜帶的位置、吸收強弱都不相同。一般而言，遠(yuǎn)紫外雙負(fù)峰(209 nm和222 nm左右的兩個負(fù)峰)是α-螺旋結(jié)構(gòu)的典型譜形，其形狀與主鏈構(gòu)象密切相關(guān)(圖3)[61]。β-折疊的CD譜在215 nm有一負(fù)峰，研究發(fā)現(xiàn)，β-折疊的CD譜與溶劑有較密切的關(guān)系，因此相應(yīng)地,β-折疊的橢圓率值不如α-螺旋恒定，無規(guī)卷曲在198 nm的負(fù)峰并在220 nm附近有一個小而平寬的正峰。因此，根據(jù)所測得蛋白質(zhì)或多肽的遠(yuǎn)紫外CD譜，能反映出蛋白質(zhì)或多肽鏈二級結(jié)構(gòu)的信息。

圖3 多肽的圓二色光譜

3.7 拉曼光譜(Raman spectrum)

拉曼光譜是一種富含信息的分析技術(shù)，該方法可以分析作用前后不同基團(tuán)振動譜帶的變化，從而判斷外源分子與DNA相互作用的結(jié)合機理及作用位點。其最大優(yōu)點就是通用性好，因而不論在均相還是多相介質(zhì)中都可以方便地應(yīng)用，并有可能提供多相微環(huán)境對其它分子與DNA相互作用的影響。激光拉曼光譜能夠顯示血清白蛋白分子中肽鍵的特征性振動譜帶、主鏈骨架的振動譜帶以及側(cè)鏈的振動譜帶。因此，可以利用肽鍵的特征性振動譜帶作為指標(biāo)來推斷血清白蛋白主鏈構(gòu)象，Langlais等[62]借助拉曼光譜對一些金屬與ctDNA相互作用的構(gòu)象變化、結(jié)合位點的研究表明，金屬離子濃度較低時，金屬離子與DNA上的磷酸基團(tuán)結(jié)合，并導(dǎo)致聚核苷酸結(jié)構(gòu)的微小變化。

3.8 紅外光譜(Fourier transform infra-red spectrum，F(xiàn)TIR)

傅立葉變換紅外光譜以及與之相應(yīng)的傅立葉自卷積和二階導(dǎo)數(shù)譜的分析也可用于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的指認(rèn)，從而成為一種新的研究生物大分子與小分子相互作用的手段[63～65]。蛋白質(zhì)紅外光譜的酞氨I帶主要是其氨基酸殘基的C=O伸縮振動吸收，各種不同的二級結(jié)構(gòu)與羰基和酰胺的氫之間形成的氫鍵有關(guān)。關(guān)于蛋白質(zhì)酰胺I帶譜峰歸屬一般為：1650～1658 cm-1為α-螺旋；1610～1640 cm-1為β-折疊；1658～1695 cm-1為β-轉(zhuǎn)角；無規(guī)卷曲的吸收子帶在1657 cm-1左右。Tang等[27]采用熒光光譜、傅立葉變換紅外光譜聯(lián)合計算機模擬技術(shù)研究了滅鼠劑敵鼠與HSA的相互作用。結(jié)果表明，與敵鼠作用后，HSA的α-螺旋含量降低，β-轉(zhuǎn)角含量增加，而β-折疊幾乎沒有變化。

4 結(jié)語

隨著各種光譜技術(shù)不斷發(fā)展，新的理論及實驗技術(shù)不斷涌現(xiàn)，以及對SA及DNA立體結(jié)構(gòu)的清晰了解，外源小分子與DNA、蛋白質(zhì)相互作用的研究不斷深入，光譜技術(shù)在環(huán)境污染物與生物大分子相互作用的研究中發(fā)揮著更為重要的作用。

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