張曉波,趙 艷,樊俊華

(1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院,海南儋州 571737;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,山西太谷 030801)

膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)俗稱鉀細(xì)菌,國(guó)內(nèi)一些學(xué)者也稱為硅酸鹽細(xì)菌[1]。長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)于這個(gè)種的特性一直有著不同的意見(jiàn),其分類地位、名稱直到1998年才得到國(guó)際上承認(rèn)[2]。膠質(zhì)芽孢桿菌是目前應(yīng)用于生物鉀肥中的一種重要功能菌,能分解硅酸鹽和鋁酸鹽組成的含鉀礦物,也能活化硅、磷等多種營(yíng)養(yǎng)元素供作物吸收利用,同時(shí)具有固氮功能[3]。

近年來(lái)我國(guó)大部分地區(qū)土壤由于長(zhǎng)期偏施氮、磷肥,少施或不施鉀肥,使得土壤中鉀素被作物大量帶走而得不到補(bǔ)充,從而抑制其他元素的吸收影響了作物的生長(zhǎng)和高產(chǎn)[4,5]。因此,在鉀肥生產(chǎn)污染嚴(yán)重,成本高,供不應(yīng)求的情況下,研究開(kāi)發(fā)以成本低,又不污染環(huán)境的膠質(zhì)芽孢桿菌為有效活菌的生物鉀肥尤為重要[6]。試驗(yàn)對(duì)山西地區(qū)褐土中篩選到的膠質(zhì)芽孢桿菌進(jìn)行了形態(tài)特征和生理生化特性研究,為生物鉀肥的研制及應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試土樣及菌株

分離膠質(zhì)芽孢桿菌的土樣分別采自山西地區(qū)有代表性的褐土(表1)。

膠質(zhì)芽孢桿菌參照菌株標(biāo)記為K0,由遼寧省菌種保藏中心提供;從采集土樣中分離、篩選的6株膠質(zhì)芽孢桿菌菌株,標(biāo)記為 K1 、K2、K3 、K4、K5、K6。

1.2 培養(yǎng)基

硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)進(jìn)行[7],蔗糖5.0 g,CaCO30.1 g,Na2HPO42.0 g,FeCl30.005 g,MgSO4?7H2O 0.5 g,土壤礦物1.0 g,Agar 20 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0。

土壤礦物為去除有機(jī)殘?bào)w的土壤,取校園土3 g,加入20%HCl 30 mL,煮沸30 min,過(guò)濾,用蒸溜水淋洗至無(wú)氯離子反應(yīng)。

1.3 方法

1.3.1 根際土樣的采集 在每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣地內(nèi)按S形隨機(jī)選擇5個(gè)植株,采集根際土樣時(shí)先去除表層的落葉以及枯草,然后將植株整個(gè)帶根系小心挖出,輕輕抖落根系上的大塊土壤,用刮刀刮下黏附于根系表面約2 mm土壤,帶回實(shí)驗(yàn)室。

表1 褐土性土壤理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of cinnamon soil

1.3.2 分離與純化 采用硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基分離。制備土壤懸液10-2,10-3和10-43個(gè)稀釋度,設(shè)3個(gè)重復(fù),涂沫平板法,30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。挑選符合文獻(xiàn)[8]膠質(zhì)芽孢桿菌菌落特征的典型菌落,在固體平板上劃線培養(yǎng)7 d,再挑取單個(gè)菌落如此重復(fù)劃線2～3次,同時(shí)鏡檢其純度,直至獲得純培養(yǎng)。

1.3.3 菌株生物學(xué)特性測(cè)定 (1)將供試菌株接種在硅酸鹽細(xì)菌液體培養(yǎng)基中,置于28℃恒溫培養(yǎng)6 h,觀察是否形成菌膜、菌環(huán)、沉淀或渾濁等特征;用接種環(huán)接菌在平板培養(yǎng)基上劃線,28℃恒溫培養(yǎng)5～6 d,觀察并描述其菌落大小、形狀、顏色、是否透明、是否粘稠等;(2)用24 h菌齡的純培養(yǎng)物制片革蘭氏染色后鏡檢觀察其染色結(jié)果;用淀粉銨鹽培養(yǎng)基[9]培養(yǎng)3 d后,用芽孢染色法[10]觀察其著生位置、形狀等;用斜面培養(yǎng)3 d、7 d的培養(yǎng)物,用負(fù)染色法[10]染色觀察其莢膜大小及莢膜內(nèi)菌體變化情況;取連續(xù)傳代培養(yǎng)兩次的菌種接種到新鮮配制的瓊脂斜面上(有冷凝水),30℃培養(yǎng)24 h,用硝酸銀染色后觀察;簡(jiǎn)單染色后在數(shù)碼顯微鏡下測(cè)菌體長(zhǎng)、寬;(3)在硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基中不加CaCO3,倒平板前用滅菌的HC1或NaOH調(diào)節(jié)制備幾個(gè)濃度梯度pH的平板,以pH 7.0為對(duì)照,接種后置28～30℃培養(yǎng),觀察記錄其生長(zhǎng)狀況;同時(shí),配制含不同NaCl濃度(1%、2%、3%、4%)的硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基,滅菌后倒平板,接種供試菌株培養(yǎng),以常規(guī)的硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基為對(duì)照,觀察記錄其生長(zhǎng)狀況及測(cè)定耐鹽性;再將供試菌株接種于硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基平板上,分別置于10、25、30、40、60 ℃下培養(yǎng),觀察其生長(zhǎng)狀況和適宜溫度;然后將供試菌株活化后(培養(yǎng)18～24 h),接種于硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基斜面上,置于28～30℃培養(yǎng),7 d后,在豐滿的菌苔上滴加l mL 3%H2O2,進(jìn)行過(guò)氧化氫酶檢測(cè),5 mm內(nèi)出現(xiàn)氣泡為陽(yáng)性反應(yīng),記錄為“+”,否則為“-”;其他生化性狀唯一碳源利用、唯一氮源利用、甲基乙酰甲醇試驗(yàn)(VP試驗(yàn))、淀粉水解、明膠水解、脲酶、酪素水解、產(chǎn)吲跺試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨等均按常用方法[11]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物學(xué)特征

2.1.1 培養(yǎng)性狀 膠質(zhì)芽孢桿菌在無(wú)氮的硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基上形成直徑7～13 mm的無(wú)色透明隆起菌落,像半粒玻璃珠平貼于平板上(圖1);菌落光滑,濕潤(rùn)有光澤,邊緣整齊,粘稠,富有彈性,挑起時(shí)能拉成很長(zhǎng)的絲;在液體培養(yǎng)條件下,分離的膠質(zhì)芽孢桿菌能在培養(yǎng)液底部形成透明的霧狀沉淀,沉淀膠結(jié)成團(tuán),不易搖散,培養(yǎng)液不渾濁。

2.1.2 形態(tài)特征及染色反應(yīng) 分離所得到的膠質(zhì)芽孢桿菌革蘭氏染色均為陰性,菌體呈桿狀,兩端鈍圓,菌體大小為(1.14～1.27)×(4.1～7.0)μ m,無(wú)鞭毛,在淀粉銨鹽培養(yǎng)基上易形成芽孢,芽孢位于孢囊中部,孢囊不膨大。在阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基中包圍有橢圓形肥大莢膜,這與文獻(xiàn)[10]描述的特征一致。莢膜約比菌體大10～20倍,有的2個(gè)或多個(gè)菌體共用一個(gè)莢膜(即菌膠團(tuán))(圖2),而到了培養(yǎng)后期(第10 d),許多菌體已經(jīng)消融僅剩下莢膜。

2.1.2 生理生化特征 供試菌株均能在葡萄糖、木糖、甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng);所有的菌株都能利用硝酸鹽和銨鹽作為其唯一的氮源;此外還具有硝酸鹽還原、淀粉水解等特征,過(guò)氧化氫酶、溶菌酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性反應(yīng),不水解酪素、酪氨酸,不產(chǎn)生吲哚,苯丙氨基酸脫氨、VP反應(yīng)、卵磷脂酶均為陰性,這與李楊[13]、何琳燕[14]、賀積強(qiáng)[15]等的研究結(jié)果一致(表2)。

圖1 膠質(zhì)芽孢桿菌菌落Fig.1 Pictures of Bacillusmucilaginosus colony

圖2 膠質(zhì)芽孢桿菌莢膜(1000×)Fig.2 Picture of Bacillus mucilaginosus capsule(1000×)

表2 供試膠質(zhì)芽孢桿菌的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of Bacillus mucilaginosus

供試膠質(zhì)芽孢桿菌在NaCl濃度為1%～2%的硅酸鹽培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)。菌株K5在3%NaCl濃度下仍能生長(zhǎng);耐堿能力較強(qiáng)的菌株有K3、K6、K0,這些菌株可以在pH 9.0時(shí)生長(zhǎng)。結(jié)果分析,膠質(zhì)芽孢桿菌在pH 5.0～9.0可以生長(zhǎng),最適pH 8.0;供試膠質(zhì)芽孢桿菌在溫度25～30℃都可以生長(zhǎng),菌株K2、K6在較低溫度10℃能生長(zhǎng),但生長(zhǎng)緩慢。

3 討論

微生物肥料的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用目前尚有許多缺點(diǎn),但在綠色產(chǎn)品生產(chǎn),啟動(dòng)土壤磷、鉀庫(kù)資源、減少化肥的投入及環(huán)保等諸多方面具有深遠(yuǎn)的意義,選育優(yōu)良菌株是該領(lǐng)域持續(xù)發(fā)展的科研目標(biāo)。

陳廷偉、陳華癸等[12]發(fā)現(xiàn),硅酸鹽細(xì)菌在我國(guó)分布很廣,各地土壤中經(jīng)常發(fā)現(xiàn),且分離菌株的形態(tài)差異不大。賀積強(qiáng)等[15]對(duì)40株來(lái)自紫色土的硅酸鹽細(xì)菌進(jìn)行了包括形態(tài)、生理生化特征等52個(gè)表型性狀的測(cè)試,認(rèn)為硅酸鹽細(xì)菌在表型特征上存在多樣性,主要是膠凍樣芽孢桿菌,其余菌株可能是新種。試驗(yàn)在山西褐土6個(gè)不同生境土壤樣品中分離純化得到6株膠質(zhì)芽孢桿菌,在無(wú)氮硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落、菌體與對(duì)照菌株一致,同時(shí)也與何琳燕等[16]描述一致,表現(xiàn)出特有的生理生化性質(zhì),說(shuō)明膠質(zhì)芽孢桿菌在各類農(nóng)田土壤中廣泛存在,具有一定的生物多樣性。

從山西褐土地區(qū)典型植物根際篩選得到的6株膠質(zhì)芽孢桿菌可為下一步生物鉀肥的研制及應(yīng)用提供材料,對(duì)挖掘褐土土壤的潛在肥力,發(fā)展褐土地可持續(xù)農(nóng)業(yè)具有一定的理論與實(shí)際意義[17]。

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