楊淑君,陳秀蓉,姜 平,楊成德,葉 震

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心甘肅蘭州 730070)

根部入侵真菌是指已經(jīng)侵入寄主植物根部,經(jīng)表面消毒又不能將其殺死,肉眼觀察又看不到癥狀的一類真菌。不同于土壤真菌,后者吸收植物根系分泌物或營(yíng)腐生活,分解植物殘?bào)w,在自然界物質(zhì)循環(huán)中起重要作用。另外,它又不同于菌根菌,因?yàn)榫蔀榧闹魈峁┮恍┧趾蜖I(yíng)養(yǎng)[1]。我國(guó)微生物學(xué)者在草地微生物方面所做的工作主要集中在內(nèi)蒙古草原和東北羊草草原上,且主要針對(duì)土壤微生物,大都應(yīng)用傳統(tǒng)的方法對(duì)土壤微生物數(shù)量季節(jié)的變化,微生物量及環(huán)境條件對(duì)微生物的影響等方面的研究[2-4]。南志標(biāo)[5-7]等對(duì)甘肅環(huán)縣溫帶典型草原區(qū)種植的不同年限的沙打旺植株及黃土高原區(qū)苜蓿與小麥輪作系統(tǒng)的根部入侵真菌進(jìn)行了研究,在沙打旺根部共獲得31種真菌,在輪作系統(tǒng)的小麥根系和苜蓿側(cè)根分別得到26和23種真菌,其中22種為共同的根部入侵真菌,而對(duì)高寒草地優(yōu)勢(shì)根際真菌及其功能的研究較少報(bào)道。

通過采用組織培養(yǎng)分離法,對(duì)甘肅省天?？h金強(qiáng)河高寒草地4種典型草地類型的樣地所采集的優(yōu)勢(shì)植物進(jìn)行分離、純化、鑒定、保存,以期為進(jìn)一步研究根部入侵真菌種群動(dòng)態(tài)及生境提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 采樣地概況

試驗(yàn)地甘肅省天?？h金強(qiáng)河上游永豐灘甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)高山草原試驗(yàn)站。海拔2 900～4 200 m,地理坐標(biāo) N 37°11′～37°11′,E 102°29′～102°33′,年均降水量416 mm,年蒸發(fā)量1 430.4 mm,年均氣溫-1℃,7月平均氣溫12.7℃,1月為-18.7℃,大于0℃的積溫為1 380℃,無絕對(duì)無霜期,屬高寒天然草地。

1.2 供試材料

選擇當(dāng)?shù)?種典型草地類型中的優(yōu)勢(shì)牧草或亞優(yōu)勢(shì)牧草9種,分離其根部入侵真菌,珠芽蓼草地有珠芽廖(Polygonum viviparum)狹穗針茅(Stipa regeliana)、麻花艽(Gentiana straminea);禾草草地有草地早熟禾(Poa pratensis)、冷蒿(Artemisia f rigida)、紫花針茅(Stipa purpurca);沼澤草地有平車前(Plantago depressa);蒿草草地有線葉嵩草(Kobresia capilli f olia)、秦艽(Gentiana macrophylla)。

1.3 采樣方法

選擇生長(zhǎng)正常有代表性的植株,取大小相近的植株全根系,每種5株,4℃保存,3日內(nèi)分離完畢。

1.4 分離培養(yǎng)

采用常規(guī)組織分離培養(yǎng)[8],培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA),滅菌后在超凈工作臺(tái)上分離。選取植株主根上、中、下部及側(cè)根中部,在清水中用力振蕩4～5 min,倒去清水,用 1%HgCl2溶液消毒 2 min,滅菌水清洗3次,用滅菌濾紙吸去表面水分后切成長(zhǎng)4 mm小段,混勻后隨機(jī)取樣,置于PDA培養(yǎng)基上,每皿5小段,重復(fù)4次,置 22 ℃下培養(yǎng)。5 d后觀察菌落形態(tài),7 d后測(cè)定菌落大小,每種菌測(cè)定30個(gè)孢子大小。如出現(xiàn)鐮孢菌,則將其立即轉(zhuǎn)入馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)上。同時(shí)對(duì)其他各種真菌,純化后置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 鑒定

將經(jīng)單孢純化的真菌菌絲接種到PDA和PSA兩種培養(yǎng)基上,于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),5 d后記錄菌落直徑大小、顏色變化;用載片培養(yǎng)法[8]觀察大、小型分生孢子和厚垣孢子形狀及著生方式;產(chǎn)孢細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn);并測(cè)量30～50個(gè)鐮孢菌大、小孢子的長(zhǎng)和寬,參考有關(guān)文獻(xiàn)[9-16],進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 各植物入侵真菌的數(shù)量和比例

分離的9種牧草根部共發(fā)現(xiàn)真菌8屬,分別是鐮孢菌屬(Fusarium sp.)、絲核霉屬(Rhizoctnia sp.)、曲霉屬(Aspergillus sp.)、Chlamydomucos sp.)、黑蔥花屬(Periconia sp.)、鑲孢霉屬(Coniathecium sp.)、絲葚霉屬(Papulaspora sp.)、青霉屬(Penicillium),在鑒定種中鐮孢菌為優(yōu)勢(shì)種,共8種占28.57%,曲霉次之,共4種占 14.29%,青霉 2種占 0.07%,其它屬相對(duì)較少。此外,不同牧草根部入侵真菌種群和數(shù)量不同,草地早熟禾上有4株真菌,屬于3個(gè)屬,分別為曲霉(Aspergillus sp.)4、青霉(Penicillium sp.)和黑蔥花屬(Periconia sp.),而麻花艽和紫花針茅上都僅僅有1種,分別是鐮孢菌(Fusarium sp.)6和鐮孢菌(Fusarium sp.)8。

表1 9種牧草根部入侵真菌種群Table 1 Root-invading fungi of 9 Herbage Species

2.2 各寄主植物入侵真菌的形態(tài)特征

2.2.1 平車前 (1)絲葚霉(Papulaspora sp.)屬真菌界半知菌亞門,絲孢綱,無孢目。菌落灰色,大型,直徑5～6 cm,菌表平鋪,生長(zhǎng)均勻,較厚,絮絨狀至粗絨狀。菌背黑色至灰色,菌絲初無色,很細(xì),后變淡灰色,粗3.53～5.88 μ m。有隔膜,菌絲上大量形成球狀膨大體,或呈念珠狀。單生、串生、頂生,大小(24.76～38.18)×(21.17～38.81)(26.83～24.25)μ m,后期大量形成絲葚狀體,不產(chǎn)孢(圖1)。(2)鐮孢菌(Fusarium sp.)1屬真菌界半知菌亞門,孢綱,孢目。菌落白色,中型,直徑 1.5 m,稍隆起,菌表致密,菌背中央黃褐色,邊緣米白色。菌絲無色,有隔。粗細(xì)1.18～1.76μ m。均勻,小型分生孢子近梭形 ,兩端尖,大小(4.12～5.88)×(1.18～1.76)(5.0×1.38)μ m。未產(chǎn)生大型分生孢子。產(chǎn)孢梗,基部粗,上部細(xì),如楔形。大小(7.06～12.94)×(1.14～1.76)(9.64×1.69)μ m(圖2)。(3)鐮孢菌(Fusarium sp.)2屬真菌界半知菌亞門,絲孢綱,絲孢目。菌落白色,大中型。菌落直徑3.5～4 cm,隆起,繁茂,較致密 ,粉絮狀 ,稀稠不均 ,高低不平,菌背中央紫紅色,邊緣白色。菌絲無色,有隔,粗1.18～4.70 μ m。菌絲上產(chǎn)生很多薄壁無色,球形,橢圓形膨大體,間生、頂生,一端稍膨大。未產(chǎn)生大孢子,僅見個(gè)別小型分生孢子(圖3)。

圖1 絲葚霉Papulaspora sp

圖2 鐮孢菌Fusarium sp.

2.2.2 秦艽 (1)鐮孢菌(Fusarium sp.)3屬真菌界半知菌亞門,絲孢綱。菌落中型 2～3 cm,灰色,不規(guī)則形,明顯隆起,邊緣放射狀,羽狀,菌背黑色。菌絲灰黑色 ,有隔膜,粗細(xì) 1.18～2.35 μ m,光滑,直 ,大量產(chǎn)生短桿狀,橢圓形,小型分生孢子,單胞。大小(3.53～8.23)×(1.76～2.35)(6.17×1.91)μ m。產(chǎn)孢梗無色至淡灰色,菌絲結(jié)成的糾集團(tuán),未見大型分生孢子。(2)鐮孢菌(Fusarium sp.)4屬真菌界半知菌亞門,絲孢綱。菌落白色,稍隆起,中度致密,菌表絨狀。菌背白色,邊緣放射狀,中部稍顯淡黃至灰綠色,菌絲無色,有隔膜,粗 1.18～4.70 μ m,較直 ,菌絲上有壁薄,無色的,球形,橢圓形膨大體。根據(jù)菌落形態(tài),菌絲膨大體基本判定為鐮孢菌。

2.2.3 線葉嵩 (1)鐮孢菌(Fusarium sp.)5屬真菌界半知菌亞門,絲孢綱。菌落中小型,直徑1.3～1.8 cm,菌表白色,稍隆起,蛛絲狀,后變黃色,菌背黃色至橙黃色。菌絲無色,有隔,粗 1.18～1.76μ m。大量形成單孢,無色,短桿狀,兩端細(xì)的小型分生孢子,大小(3.53～8.23)×(1.18～2.35)(5.81～1.72)μ m。產(chǎn)孢梗單瓶梗,大小(11.76～20.0)×(1.76～2.11)(16.0×1.81)μ m。未產(chǎn)生大型分生孢子。(2)曲霉(Aspergillus sp.)1屬真菌界半知菌亞門,絲孢綱。菌落大型,＞3.5 cm。黃綠色至暗黃綠色。稍隆起,菌表粉絨狀,現(xiàn)輪紋。菌背灰綠色,底部有很多灰綠色小點(diǎn) 。菌絲無色,有隔,粗 1.76～2.94 μ m,粗細(xì)不均 ,有膨大體,分生孢子梗無色,無隔,大小(438.94～568.83)×(6.72～10.3)(516.58×8.66)μ m。稍彎曲,頂端膨大,呈球形,直徑 32.93 μ m,分生孢子球形,近球形,串生,淡黃褐色,壁稍厚,大小2.35～5.88(3.79)μ m(圖4)。

圖3 鐮孢菌2Fusarium sp.2

圖4 曲霉 Aspergillus sp.

2.2.4 麻花艽 (1)鐮孢菌(Fusarium sp.)6屬真菌界半知菌亞門,絲孢綱。菌落白色,隆起,絮狀,密厚,后期菌表有團(tuán)絮狀小顆粒,后部紫紅色,菌絲無色,有隔,后變粗4.70～5.88 μ m。產(chǎn)生薄壁,橢圓形,近球形膨大體,大小不等,小型分生孢子長(zhǎng)橢圓形,橢圓形,單孢,兩端稍細(xì),大小(7.01～9.41)×(2.94～3.53)(7.80×3.41)μ m,菌絲間生厚垣孢子。

2.2.5 珠芽蓼 (1)曲霉(Aspergillus sp.)2菌落綠色發(fā)黃,平鋪,菌表粉狀,稀疏。菌背米灰色,稍發(fā)綠。菌絲無色,有隔,粗 3.53～4.76 μ m。分生孢子梗(559.88～1218.29)×(6.72～14.78)(706.03×10.40)μ m。上部較粗,下部較細(xì),頂端膨大體球形,無色,大小(22.34～37.63)×(27.05～35.28)(32.93×28.93)μ m(高寬)。分生孢子梗球形,近球形,無色至淡橄欖色,串生,壁上有小突起,內(nèi)有油珠,孢子大小2.94～4.70(3.95)μ m 。

2.2.6 冷蒿 (1)曲霉(Aspergillus sp.)1同2.2.3。(2)鑲孢霉(Coniatheciun sp.)1屬真菌界半知菌亞門,絲孢綱。菌落灰褐色至灰黑色,平鋪,大型,菌表絲絨狀,菌背黑色,菌絲淡褐色。有隔,初期很細(xì),后變褐色,粗4.70～5.88 μ m。直,菌絲上形成大小不等的串珠狀厚壁孢子,壁不光滑,有小突起,大小(8.23～4.11)×(8.23～14.11)(6.17×10.75)μ m。另外,形成近球形,橢圓形,黑褐色厚壁孢子球,大小(18.82～52.92)×(18.82～32.93)(29.08×24.57)μ m(圖5)。

2.2.7 狹穗針茅 (1)鐮孢菌(Fusarium sp.)7屬真菌界半知菌亞門,絲孢綱。菌落白色,大中型,直徑3～4 cm,稍隆起,菌表粉絨狀,中等繁茂,菌背米灰色,稍發(fā)紫,菌絲無色,有隔,初期較細(xì),后變粗至 3.53 μ m,有些菌絲結(jié)成束。小型分生孢子單孢。卵圓形,橢圓形,大小(3.53～5.88)×(2.94～3.53)(4.32×3.38)μ m,量多,未見大型分生孢子。(2)絲核菌(Rhizoctonia sp.)1,菌落米白色,平鋪 ,細(xì)絨狀 ,大型 ＞4 cm,放射狀,菌背米黃色,菌絲無色,有隔,分枝成直角,莖部縊縮,粗細(xì) 5.9～7.1(6.6)μ m,有些菌絲交織在一起。(3)曲霉(Aspergillus sp.)3屬真菌界半知菌亞門,絲孢綱。菌落白色,微發(fā)黃,平鋪,稀疏,稍顯粉粒狀,中小型2～3μ m,菌背米白色,菌絲無色,有隔,粗細(xì) 1.18 μ m。分生孢子梗963.0～1 630.4(1 280.5)μ m,頂部膨大,近球形,大小(37.63～59.98)×(32.93～49.40)(47.88×41.33)μ m,分生孢子球形,無色至淡褐色,內(nèi)部有油珠,孢子大小3.53～4.70(4.20)μ m。

2.2.8 禾草 (1)黑蔥花屬(Periconia sp.)1屬真菌界半知菌亞門,絲孢子綱。菌落黑灰色,大型＞4 cm,平鋪,菌表細(xì)絨狀,菌背黑色,菌絲褐色,有隔,粗 2.35～3.35 μ m,粗細(xì)均勻,硬壁厚直,隔多 ,隔處縮成橢圓形,球形,形成孢子,初無色至淡褐色,壁厚,大小 2.35～3.53(2.94)μ m。其后,孢子聚集成大小不等的球形,橢圓形孢子球,大小為 40.31～58.23 μ m,最大達(dá)277.7 μ m 。(2)曲霉(Aspergillussp.)4屬真菌界半知菌亞門,絲孢綱。菌落大中型,2～4 cm,灰色發(fā)黑,稀疏,平鋪,菌表粉狀,菌背淡灰黑色。菌絲褐色,有隔,2.35～2.94 μ m,粗細(xì)均勻,菌絲頂端膨大成球形,大小(11.76～27.05)×(11.76～25.87)(16.46×14.01)μ m,分生孢子梗長(zhǎng) 172.87～165.78(220.62)μ m,上部較粗 ,約 7.56 μ m,下部較細(xì) 3.53～4.70 μ m,分生孢子較小。(3)青霉(Penicillium sp.)1菌落中小型,1.5～2.0 cm,蘭灰色,稍隆起,平鋪,菌表粉狀,菌背黃褐色。菌絲無色,有隔,粗細(xì) 1.18～2.94 μ m,掃狀分枝,分枝2～5次,第 1次分枝 11.47×2.65 μ m,第 2 次分枝12.35×2.65 μ m,第 3次分枝(5.88～7.03)×1.76(6.17×1.76)μ m,分生孢子球形,無色 ,大小 2.35～3.53(2.94)μ m(圖 6)。(4)青霉(Penicillium sp.)1屬真菌界半知菌亞門,絲孢綱。菌落黑灰色,小型＜1 cm,稍隆起,餅狀,緊密,粉狀,菌背土黃色。菌絲無色,有隔 ,粗1.18～1.76 μ m,掃狀分枝,頂端分枝 2 次,分生孢子球形,近球形,無色。淡橄欖色,大小2.12～2.70(2.30)μ m。

2.2.9 紫花針茅 (1)鐮孢菌(Fusarium sp.)8屬真菌界半知菌亞門,絲孢綱。菌落白色,繁茂,隆起,較疏松,粗絮狀,菌背土黃色,菌絲無色至淡黃色,有隔,1.18～4.7 μ m,較直,小型分生孢子短桿狀 ,單孢,無色,直或稍彎曲,大小(7.06～14.11)×(1.18～3.53)(10.4×1.47)μ m,未見大型分生孢子。

圖5 鑲孢霉(Fusarium sp.)

圖6 青霉1(Penicillium sp.)

3 討論

(1)分離的9種植物根部共發(fā)現(xiàn)真菌7屬,其中,鐮孢菌為優(yōu)勢(shì)屬種,曲霉屬次之,而其他幾種真菌均未鑒定到種,韓玉竹[18]認(rèn)為可能是3點(diǎn)原因,首先,時(shí)間因素。其次,不產(chǎn)孢是阻礙鑒定的因素。此外,我國(guó)高寒草地的研究較少,缺乏相關(guān)的資料和工具書。9種植物中草地早熟禾入侵真菌較多,而麻花艽和紫花針茅上都僅有1種,這與根部有機(jī)質(zhì)及植物本身有關(guān)。

(2)對(duì)植物組織分離法獲得的真菌進(jìn)行了鑒定,會(huì)出現(xiàn)由于消毒不徹底而分離到根表的一些真菌。因此,需要進(jìn)行回接試驗(yàn),最終確定真正的入侵真菌。

[1]池振明.現(xiàn)代微生物生態(tài)學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2005.

[2]李真香,陳佐忠.不同放牧方式對(duì)草原土壤 C、N、P含量的影響[J].草地學(xué)報(bào),1998,6(2):90-98.

[3]趙吉,廖仰南.原生態(tài)系統(tǒng)的土壤微生物生態(tài)[J].中國(guó)草地,1999(3):57-67.

[4]郭繼勛,祝延成,馬文明,等.東北羊草草原土壤微生物與生態(tài)環(huán)境的關(guān)系[J].草地學(xué)報(bào),1996,4(4):240-245.

[5]尹亞麗,南志標(biāo),李春杰,等.沙打旺根部入侵真菌的研究[J].草原與草坪,2006(1):45-53.

[6]郭玉霞,南志標(biāo),王成章,等.苜蓿根部入侵真菌研究進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué),2009(5):243-249.

[7]郭玉霞,南志標(biāo),李春杰,等.黃土高原區(qū)苜蓿與小麥輪作系統(tǒng)根部入侵真菌研究[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2004(3):486-494.

[8]方中達(dá).植病研究方法[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1998.

[9]戴芳瀾.中國(guó)真菌總匯[M].北京:科學(xué)出版社,1979.

[10]王拱辰,鄭重,葉琪明,等.常見鐮刀菌鑒定指南[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社,2000.

[11]魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上?？萍汲霭嫔?1979.

[12]唐姆茨 K H,蓋姆斯 W.農(nóng)業(yè)土壤真菌[M].北京:科學(xué)出版社,1979.

[13]孔華忠.中國(guó)真菌志?青霉屬及其相關(guān)有性型[M].北京:科學(xué)出版社,2007.

[14]齊祖同.中國(guó)真菌志?曲霉屬及其相關(guān)有性型[M].北京:科學(xué)出版社,1997.

[15]巴尼特,亨特.半知菌圖解[M].北京:科學(xué)出版社,1977.

[16]O'Donnell K.Progress towards a phylogenetic classification of Fusarium[J].Sydowia,1996,48:57-70.

[17]祖若夫,胡寶龍,周德慶.微生物實(shí)驗(yàn)教程[M].上海:復(fù)旦大學(xué)出版社,1993.

[18]韓玉竹.東祁連山高寒草地土壤微生物生態(tài)分布及其優(yōu)勢(shì)菌的鑒定[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.