肖向梅

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展, 糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、化療放療、器官移植、各種導(dǎo)管和插管技術(shù)的應(yīng)用, 特別是抗生素的濫用和社會老齡化，白色念珠菌作為一種條件致病菌, 其感染率逐年上升[1-2]。為探討白色念珠菌耐藥機(jī)制, 我們對從臨床感染患者中分離的耐氟康唑(FLC)和伊曲康唑(ITC)的白色念珠菌擴(kuò)增編碼羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)基因，并將擴(kuò)增序列與參考序列進(jìn)行比對和分析，以了解白色念珠菌的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 白色念珠菌耐藥株的篩選和鑒定 經(jīng)CHROMagar念珠菌顯色培養(yǎng)基(CHROMagar公司,法國)初篩，API20C Aux酵母菌鑒定系統(tǒng)(bioMérieux公司,法國)和45℃生長實(shí)驗(yàn)，鑒定為白色念珠菌。紙片擴(kuò)散法初篩白色念珠菌耐藥株，然后按NCCLS推薦的微量稀釋法(M-27A)測定白色念珠菌對氟康唑(FLC)、伊曲康唑(ITC)的MIC。分離到兩株白色念珠菌耐藥株(FLC≥64μg/ml、ITC≥16μg/ml), 均未并發(fā)呼吸道感染的重癥患者(2007H和2007T株)。

1.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)Genbank X13296序列，利用DNA star軟件輔助設(shè)計三對PCR引物，分別從N、C端和中間，擴(kuò)增羊毛甾醇14α-去甲基化酶(14DM)的編碼基因，并使三個引物擴(kuò)增片段相互重疊，保證序列的準(zhǔn)確性。引物由上海生物工程技術(shù)公司合成。引物序列及其相應(yīng)的位置、擴(kuò)增片段大小，如表1所示。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 美國PERKIN公司DNA擴(kuò)增儀；法國Gilson公司各型號移液器；PCR試劑，DNA純化試劑盒購自promega公司；PCR marker DL2000購自Takara公司。其它化學(xué)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.4 白色念珠菌DNA的提取和擴(kuò)增及產(chǎn)物的純化 白色念珠菌DNA提取采用Promega DNA提取試劑盒，按說明進(jìn)行。三對PCR引物，分別從N、C端和中間擴(kuò)增CYP51基因。取上述DNA2μl,在25μl反應(yīng)體系中擴(kuò)增。擴(kuò)增參數(shù)：95℃復(fù)性5min；95℃1min,53℃60sec,72℃60sec,30個循環(huán)；72℃5min。目的基因的純化按Wizard DNA clean up試劑盒說明書操作，送上海生物工程公司的測序分析。

2 結(jié)果

2.1 CYP51基因的PCR擴(kuò)增 理論上N、C端和中間PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為510bp、890bp和1200bp，同DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物相比較，目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相一致。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析 利用DNAstar軟件，將擴(kuò)增序列與白色念珠菌參考序列(Accession No: X 12396)進(jìn)行對比和分析。經(jīng)比較，耐藥株存在有意義突變和無意義突變，詳見表2。

3 討論

表1 引物序列及其在白色念珠菌CYP51基因中的位置

表2 白色念珠菌唑類耐藥株CYP51基因突變點(diǎn)及對應(yīng)的氨基酸變化

CYP51是白色念珠菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶(14DM)的編碼基因,大小為1851bp,起始密碼子是位于第148～150bp的ATG,終止密碼子是位于第1732～1734bp的TAA。14DM由528個氨基酸構(gòu)成,含有A-M共13個α螺旋和數(shù)個β片層以及螺旋結(jié)構(gòu)。血紅素被束縛于蛋白中央,夾在I螺旋和L螺旋之間。活性位點(diǎn)在血紅素遠(yuǎn)端,深埋于蛋白內(nèi)部,底物需通過較長的底物進(jìn)出通道才能到達(dá)。唑類抗真菌藥物分子可經(jīng)此通道與14DM結(jié)合,阻斷羊毛固醇去甲基化過程,影響麥角固醇合成。作為唑類抗真菌藥的靶酶, 14DM可以介導(dǎo)藥物的毒性作用, 而其變化也能削弱藥物的作用。當(dāng)CYP51點(diǎn)突變影響到14DM空間構(gòu)型時,就可能降低酶與藥物分子間的親和力,導(dǎo)致菌株耐藥[3-4]。

本研究中兩個耐藥株共有22個堿基突變。突變發(fā)生氨基酸替換，與以往報道的相同的有F105L、K128T、Y132H、T199I、R267H、G464S和G467K。其中，Y132H和G467K突變兩株菌都存在。Sanglard等[5]最早證實(shí)Y132H與耐藥表型相關(guān)。 Kakeya等[6-7]進(jìn)一步指出具有雙復(fù)制的Y132H (等位基因純合)才可致耐藥。Y132H常與其他突變同時出現(xiàn),當(dāng)Y132H與S405F或R467K同時出現(xiàn)時,菌株的MIC比單獨(dú)表達(dá)上升更多[5]。這種協(xié)同作用在研究I471T時也得到證實(shí): I471T單獨(dú)表達(dá)時可產(chǎn)生耐藥, Y132H與之同時表達(dá)可加強(qiáng)這一作用[6-7]。研究者分別通過在釀酒酵母中表達(dá)帶有突變的14DM,證實(shí)G464S和R467K[5]可以導(dǎo)致菌株耐藥。F105L位于底物/藥物通道入口附近,可能影響藥物分子的進(jìn)入[7]。F71L，W244R，T311N 和T352I為本研究新發(fā)現(xiàn)的突變，未見報道，它在耐藥機(jī)制中的作用需進(jìn)一步探討。總之，白色念珠菌耐藥的形成是多位點(diǎn)突變，是多步驟、復(fù)雜的，不同菌株對相同或不同藥物產(chǎn)生耐藥的機(jī)制也不同，有時可能是多機(jī)制共同作用的結(jié)果。

分離的兩株白色念珠菌耐藥株, 均來并發(fā)呼吸道感染的老年重癥患者(2007H和2007T株)，都有長期應(yīng)用抗生素和氟康唑抗真菌藥物史，反復(fù)患有細(xì)菌和念珠菌感染。因此，合理應(yīng)用抗生素，加強(qiáng)真菌感染的預(yù)防和控制，進(jìn)行深部真菌感染的流行病學(xué)研究，深入探討真菌的耐藥機(jī)制已刻不容緩。

[1]陸慧君,賀文琦,鄧旭明等.白色念珠菌DNA指紋圖譜分析及其在臨床耐藥檢測中的應(yīng)用[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2007,11(12):1606.

[2]董海新;李曉哲.醫(yī)院內(nèi)念珠菌感染及耐藥性分析[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2007,11(11):1476.

[3]Wang YB,Wang H,Guo HY,et al.Analysis of ERG11 gene mutation in Candida albicans.[J]Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao,2005,25(11):1390.

[4]Podust LM,Poulos TL,Waterman MR.Crystal structure of cytochrome P450 14α2sterol demethylase(CYP51)from Mycobacterium tuberculosis in complex with azole inhibitors[J].Proc Natl Acad SciUSA,2001,98(6):3068.

[5]Sanglard D,Ischer F,Koymans L,et al.Amino acid substitutions in the cytochrome P450 lanosterol 14alpha-demethylase(CYP51A1)from azoleresistant Cand ida albicans clinical isolates contribute to resistance to azole antifungal agents[J].Antimicrob Agents Chemother,1998,42(2):241.

[6]Kakeya H,Miyazaki Y,Miyazaki H,et al.Genetic analysis of azole resistance in the Darlington strain of Cand ida albicans.Antimicrob Agents Chemother,2000,44(11):2985

[7]Kakeya H,Miyazaki T,Miyazaki Y,et al.Azole resistance in Cand ida spp[J].Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi,2003,44(2):872.