肖海浩 湯春梅 周強 張言斌

肺結(jié)核確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”是痰細菌學(xué)。菌陰肺結(jié)核定義為三次痰涂片及一次培養(yǎng)陰性的肺結(jié)核[1]。菌陰肺結(jié)核在臨床較多見，若其診斷缺乏“金標(biāo)準(zhǔn)”，易造成臨床誤診或漏診，通過支氣鏡檢查獲得細菌學(xué)依據(jù)的方法在臨床已廣泛開展。本文回顧性分析了2008年4月～2009年10月我院住院經(jīng)支氣管鏡檢查的68例菌陰肺結(jié)核患者留取支氣管沖洗液采用涂片、培養(yǎng)、熒光定量PCR (fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)和噬菌體生物擴增法(phage amp lified biologically assay, PhaB)檢測結(jié)核分枝桿菌(m ycobacterium tubercu losis MTB)的結(jié)果，探討幾種方法對菌陰肺結(jié)核患者的臨床應(yīng)用價值?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

68例初治菌陰肺結(jié)核患者均為2008年4月～2009年10月我院住院病人，其中男40例，女28例，年齡14～78歲,平均(38.9±10.5)歲。病程1d～3a不等。所有病人支氣管鏡檢查前痰涂片找抗酸桿菌≥3次陰性，1次培養(yǎng)陰性，臨床診斷為肺結(jié)核。

1.2 檢查方法

1.2.1 支氣管鏡方法

采用日本產(chǎn)Olym pusBF-260或Pentax EB-1530T3型電子支氣管鏡。按支氣管鏡檢查技術(shù)常規(guī)進行術(shù)前準(zhǔn)備和局麻，支氣管鏡經(jīng)鼻插入，通過聲門后依次檢查氣管和各級支氣管，仔細觀察各肺段支氣管黏膜情況。對鏡下可見病變者，于直視下在病變部位進行支氣管沖洗，將生理鹽水5～10m l注入相應(yīng)的肺葉、肺段或亞段病變部位進行沖洗，再用吸引器將沖洗液收集入標(biāo)本瓶中送檢，共2～3次。對鏡下病變不明顯者，則參照影像學(xué)所示的病灶位置，將支氣管鏡插入病灶位于的段或亞段支氣管開口處，按上述沖洗方法沖洗。

1.2.2 實驗室方法

對收集的支氣管沖洗液標(biāo)本同時送檢以下4種檢測方法：⑴涂片找抗酸桿菌：按照中國防癆協(xié)會“結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程”操作,用萋-尼氏染色抗酸染色法，≥3條抗酸桿菌/300視野為陽性。⑵結(jié)核菌培養(yǎng)：用BacT/A lert3D全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)儀器系統(tǒng)(3D系統(tǒng))進行臨床標(biāo)本的分離培養(yǎng)。⑶應(yīng)用熒光定量PCR(FQ-PCR)：檢測沖洗液結(jié)核分枝桿菌DNA，DNA基因拷貝數(shù)量＞1×103拷貝/m L為陽性。⑷噬菌體生物擴增法(PhaB)：采用英國BIOTEC公司結(jié)核桿菌檢測試劑盒(FAST Plaque T B M)，培養(yǎng)器皿中出現(xiàn)大小不等的噬菌斑，噬菌斑數(shù)≥20個或許多噬菌體斑互相融合成透明狀判定為陽性，器皿中無菌斑出現(xiàn)或噬菌斑數(shù)量＜20個為陰性。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包分析數(shù)據(jù)，用x2檢驗比較不同檢測方法診斷肺結(jié)核的陽性率，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

68例菌陰肺結(jié)核患者4種支氣管沖洗液檢測方法的結(jié)果：涂片、培養(yǎng)、熒光定量PCR和噬菌體生物擴增法陽性率分別為29.4%、54.4%、33.8%和14.7%，見表1。

表1 4種支氣管沖洗液檢測方法陽性結(jié)果比較

3 討論

痰菌陰性肺結(jié)核在我國達260萬之眾，大約占全部肺結(jié)核的40%～60%[2]。由于化療、免疫功能障礙，結(jié)核桿菌的某些生物學(xué)特性發(fā)生變異，痰菌含量少或呈L型結(jié)核菌、肺部病灶局限未與引流支氣管相通等因素，均可致使痰涂片檢查陰性。研究表明，菌陰肺結(jié)核并非沒有傳染性，只是在傳染的強度上低于痰菌檢查結(jié)果陽性的肺結(jié)核，因此，菌陰肺結(jié)核并非真正意義上的細菌學(xué)陰性[3]。支氣管鏡檢查作為一種幫助診斷肺結(jié)核的重要手段，可能獲得細菌學(xué)的依據(jù)，在臨床已廣泛開展。支氣管鏡檢查通過對支氣管、肺泡的機械性刺激,活檢鉗及毛刷損傷支氣管壁和病灶邊緣，之后進行沖洗可起到疏通引流支氣管，促進痰量增加的作用。將生理鹽水于病變部位注入遠端氣道及肺實質(zhì)中，接觸病灶的范圍廣，進而負壓吸引收集沖洗液，回收量較多，含菌量相對多，深部的結(jié)核桿菌有可能被收集到?jīng)_洗液中，同時生理鹽水對支氣管的輕度刺激作用可誘發(fā)一部分病人出現(xiàn)不同程度的咳嗽，有利于深部結(jié)核桿菌排出，獲得結(jié)核分枝桿菌的機會增多[4]。因此支氣管沖洗液可能獲得較高的檢出率，與普通痰標(biāo)本相比，能更好地反映疾病性質(zhì)。

目前最基本的細菌學(xué)檢查方法——抗酸染色涂片，大多數(shù)人認為其敏感性低、特異性差，無法辨別死菌與活菌，無法判定是結(jié)核分枝桿菌還是非結(jié)核分枝桿菌，對菌量較低的標(biāo)本常易漏檢，陽性率低。但本組68例菌陰肺結(jié)核患者支氣管沖洗液涂片陽性率為29.4%，明顯高于噬菌體生物擴增法這種較新的檢測方法(P＜0.05)，與熒光定量PCR陽性率相當(dāng)(P＞0.05)，表明對于菌陰肺結(jié)核的實驗室診斷，抗酸染色涂片仍具有較好的實用價值。作為支氣管沖洗液檢查的常規(guī)方法，該方法檢測速度快，經(jīng)濟且簡單易行。

本組沖洗液培養(yǎng)結(jié)果陽性率為54.4%，反映出結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)這種傳統(tǒng)方法對于菌陰肺結(jié)核的支氣管沖洗液陽性檢出率，明顯高于涂片、熒光定量PCR和噬菌體生物擴增法(P＜0.05)。結(jié)核桿菌培養(yǎng)仍是目前診斷肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，尤其是進一步可行菌型鑒定和藥敏實驗，在指導(dǎo)臨床用藥及耐藥性監(jiān)測等方面具有重要作用，這是其他方法無法比擬的。但缺點是耗時太長，難以達到臨床上需要快速檢測的目的，傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)耗時約需6～8周，本院應(yīng)用BacT/A lert3D全自動分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)(3D系統(tǒng))使平均報告陽性時間縮短為19.30d，很大程度上改進了臨床診治的需求，但實驗費用較貴[5]。

由于結(jié)核菌生長緩慢，需要快速、靈敏和特異的病原學(xué)檢查和鑒定技術(shù)來幫助快速診斷菌陰肺結(jié)核。核酸探針和PCR為結(jié)核病細菌學(xué)基因診斷提供了可能。PCR是選用一對特定的寡核苷酸引物介導(dǎo)的結(jié)核菌某特定核酸序列的DNA體外擴增技術(shù)，它可以在短時間使特定的核酸序列拷貝數(shù)增加數(shù)百萬倍，在此基礎(chǔ)上進行探針雜交，提高了檢出的靈敏度和特異性。熒光定量PCR技術(shù)集PCR和DNA探針雜交技術(shù)的優(yōu)點為一體，直接探測PCR過程中的熒光變化，獲得DNA模板的準(zhǔn)確定量結(jié)果，可信性較高且技術(shù)簡單，操作快速，在結(jié)核早期快速診斷上具有臨床實用價值。有研究結(jié)果顯示痰液和支氣管肺泡灌洗液PCR檢測可獲得比涂片鏡檢明顯高的陽性率和略高于培養(yǎng)的陽性率，且省時快速[6-7]。缺點是由于其檢測方法靈敏度高，對標(biāo)本的要求、實驗室配置、實驗室操作人員的操作的要求很高，容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。本組68例患者應(yīng)用熒光定量PCR檢測沖洗液結(jié)核分枝桿菌DNA陽性率33.8%，與沖洗液涂片的陽性率相當(dāng)(P＞0.05)，優(yōu)于噬菌體生物擴增法(P＜0.05)。我們認為沖洗液熒光定量PCR檢測結(jié)核分枝桿菌DNA可做為快速診斷菌陰肺結(jié)核的一項病原學(xué)診斷參考檢測方法。

噬菌體生物擴增法(PhaB)是由W ilson等于1997年建立的一種結(jié)核分枝桿菌(MTB)快速檢測的新技術(shù)，近年來轉(zhuǎn)入臨床實驗室應(yīng)用的研究正逐步開展。其檢測原理是：分枝桿菌噬菌體能感染活的MTB，未感染細菌的噬菌體則被隨后加入的殺毒劑所滅活，已進入感染菌體內(nèi)的噬菌體不受影響。噬菌體在感染的菌體內(nèi)大量增殖，并將菌體裂解，釋放出子代噬菌體。釋放出的噬菌體即可感染隨后加入的指示細胞(一種快速生長的分枝桿菌)，并將其裂解。指示細胞裂解后在瓊脂平板上出現(xiàn)透亮的噬菌斑。因此，根據(jù)噬菌斑的有無即可判斷待檢細菌是否為MTB，或待檢標(biāo)本中是否存在活的MTB[8]。噬菌體在結(jié)核病快速診斷的研究報道很多，在臨床工作中針對痰結(jié)核分枝桿菌的檢測應(yīng)用較多，多數(shù)研究認為噬菌體生物擴增法檢測結(jié)核分枝桿菌具有敏感性高、特異性強、快速、簡便等優(yōu)點，不需要特殊儀器設(shè)備、技術(shù)要求低，便于在臨床實驗室推廣應(yīng)用。該方法通常24h即可獲得檢測結(jié)果，并且可以區(qū)別死菌或活菌，對及早診斷、及時治療以及療效觀察具有重要的參考價值[9-10]。但針對支氣管沖洗液結(jié)核分枝桿菌的檢測應(yīng)用較少，本組68例患者支氣管沖洗液噬菌體生物擴增法檢查的陽性率僅14.7%，明顯低于傳統(tǒng)的涂片法、培養(yǎng)和熒光定量PCR(P＜0.05)，結(jié)果不令人滿意。分析其陽性率低的原因可能是該技術(shù)尚處于實驗研究階段,對臨床應(yīng)用過程中支氣管沖洗液標(biāo)本的留取和送檢規(guī)范尚不確定。同時陽性率低可能與部分標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌為死菌或部分標(biāo)本中的含菌濃度低有一定關(guān)系[10]。另外許多人為因素可影響檢測結(jié)果，例如標(biāo)本預(yù)處理、噬菌體濃度、感染時間、殺毒劑滅活條件、指示細胞的配制等[8]。因此，支氣管沖洗液噬菌體生物擴增法檢測對于菌陰肺結(jié)核的診斷價值有待進一步研究和探索。

綜上所述，支氣管沖洗液涂片和熒光定量PCR檢測對菌陰肺結(jié)核的快速診斷具有重要的臨床應(yīng)用價值，噬菌體生物擴增法檢測對于菌陰肺結(jié)核的診斷價值有待進一步研究和探索，培養(yǎng)不僅是目前診斷肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，而且在這幾種檢測方法中陽性率最高。

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