何凌 何美艷 余綺玲 黃春苓 梁偉 王燕 陳定宇

我國(guó)最新糖尿病流行病學(xué)調(diào)查顯示，20歲以上人群糖尿病及糖尿病前期患病率已達(dá)到9.7%和15.5%[1]，世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)2025年全球糖尿病患者將達(dá)3.8億。糖尿病已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題。UKPDS研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病確診時(shí)，胰島細(xì)胞功能僅有正常的50%，隨著疾病進(jìn)展，β細(xì)胞功能進(jìn)行性衰退[2]，隨之而來的是血糖控制的難度及成本逐漸增加，患者更容易出現(xiàn)各種急、慢性并發(fā)癥。然而，目前的治療方案多集中在血糖達(dá)標(biāo)、在胰島功能不斷下降的基礎(chǔ)上使其速度延緩，尚未發(fā)現(xiàn)確切治療手段阻止胰島功能進(jìn)行性衰退。研究表明，氧化應(yīng)激和非酶糖化在β細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮了重要作用。若能尋找一種治療方式阻止其反應(yīng)，則為β細(xì)胞保護(hù)提供了又一可能途徑。氨基胍(Am inoguanidine, AG)是一種親核肼化物，可以有效抑制糖基化終末產(chǎn)物(Advanced Glycation End Products, AGE)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Ox ide Synthase，iNOS)產(chǎn)生，已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)氨基胍可預(yù)防DR-BB大鼠發(fā)生自身免疫性糖尿[3]。本研究嘗試觀察AG對(duì)胰島β細(xì)胞株NIT細(xì)胞的保護(hù)作用，為胰島β細(xì)胞的保護(hù)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

IL-1β、IFN-γ購(gòu)自R&D公司，鹽酸氨基胍、DMSO、胰蛋白酶(trypsin)及EDTA購(gòu)自Sigma公司。低糖型DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；一氧化氮、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 細(xì)胞株

胰島β細(xì)胞株N IT-1細(xì)胞由中南大學(xué)代謝內(nèi)分泌研究所周智廣教授惠贈(zèng)。

1.1.3 主要儀器

倒置顯微鏡：ZEISS，Ax iover25 CFL，德國(guó)；CO2培養(yǎng)箱：Therm o scien tific Form a 371，美國(guó)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：MULTISKAN SPECTRUM，美國(guó)；紫外/可見光分光光度計(jì)：AMERSHAM Pharmacia U ltrospec 2001，美國(guó)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀：Bayer CENTAUR，德國(guó)。

1.2 方法

1.2.1 NIT-1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

N IT-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DM EM培養(yǎng)基，5%CO2，37℃培養(yǎng)，每日換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，予0.125%胰酶消化細(xì)胞，加入含胎牛血清的DMEM終止反應(yīng)。用滴管輕柔吹打使其成為單細(xì)胞懸液，1∶3分瓶傳代。

1.2.2 細(xì)胞接種與處理

預(yù)實(shí)驗(yàn)選定終濃度：IL-1β50pg/m l，IFN-γ5ng/m l，氨基胍(以下簡(jiǎn)稱AG)0.5mm ol/L。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的N IT-1細(xì)胞與以下干預(yù)因子共培養(yǎng)于48孔板，孵育24h。分為以下4組：①(IL-1β+IFN-γ)組、②(IL-1β+IFN-γ+AG)組、③AG組、④對(duì)照組(DM EM)。每組設(shè)3個(gè)平行孔。(IL-1β+IFN-γ+AG)組為在IL-1β及IFN-γ作用前24h加入AG預(yù)先孵育，對(duì)照組加入等量DMEM，作用后收集細(xì)胞，用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 一氧化氮水平檢測(cè)

硝酸還原酶法，取上清液，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)水平檢測(cè)

比色法，取上清液，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 胰島素水平檢測(cè)

取上清液，采用化學(xué)發(fā)光法，由Bayer Cen taur分析儀完成，批內(nèi)CV3.0%，批間CV 4.1%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料用或中位數(shù)及范圍表示，計(jì)數(shù)資料用陽(yáng)性例數(shù)或率表示。正態(tài)分布數(shù)據(jù)2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，2組以上的均數(shù)比較用方差分析。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS11.0，顯著性為0.05。

2 結(jié)果

2.1 一氧化氮、iNOS水平檢測(cè)

經(jīng)IL-1β聯(lián)合IFN-γ刺激的N IT-1細(xì)胞，其分泌NO、iNOS水平較其他各組增高(vs AG組、對(duì)照組，P＜0.01；v s IL-1β+IFN-γ+AG組，P＜0.05)，其中AG+IL-1β+IFN-γ聯(lián)合處理的N IT-1細(xì)胞與IL-1β+IFN-γ破壞組相比，分泌NO，iNOS水平下降(P＜0.05)，與AG組相比，分泌NO、iNOS水平增高(P＜0.05)，見表1。

表1 各組培養(yǎng)上清NO、iNOS、胰島素水平比較

2.2 胰島素水平檢測(cè)

NIT-1細(xì)胞經(jīng)IL-1β+IFN-γ破壞，分泌Ins較其他各組減少(P＜0.05)，其中AG+IL-1β+IFN-γ刺激的N IT-1細(xì)胞與IL-1β+IFN-γ刺激組相比，分泌Ins增加(P＜0.05)與AG組及對(duì)照組無差異，見表1。

3 討論

糖尿病的發(fā)生發(fā)展涉及到遺傳與環(huán)境等多種因素共同作用，目前其病因仍未明確。人們一方面在積極尋找其發(fā)病的始動(dòng)機(jī)制，另一方面也在下游觀察一些效應(yīng)因子的作用，借此篩選出有益于保護(hù)胰島β細(xì)胞的干預(yù)靶點(diǎn)。

近年來，糖基化終末產(chǎn)物在糖尿病進(jìn)展中的作用已得到證實(shí)。AGEs是非酶糖化反應(yīng)的終末期產(chǎn)物，可沉積于血管壁，通過氧化應(yīng)激、趨化白細(xì)胞、活化蛋白激酶C等發(fā)揮作用；AGEs使內(nèi)皮源性NO生成增加或滅活減少，增加內(nèi)皮的促凝血活性，引起血流動(dòng)力學(xué)異常。AGEs可直接導(dǎo)致糖尿病微血管病變?nèi)缣悄虿∧I病及視網(wǎng)膜病變。此外，AGEs通過iNOS依賴性NO生成途徑來抑制細(xì)胞色素氧化酶C及ATP產(chǎn)生，借此導(dǎo)致胰島素分泌功能受損[4]；AGE尚可沉積于胰島損傷β細(xì)胞功能，出現(xiàn)胰島素分泌缺陷及胰島素基因啟動(dòng)子活性下降[5]。T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子是導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡的效應(yīng)因子。而細(xì)胞因子誘導(dǎo)的NOS(iNOS)及隨后的NO分泌在β細(xì)胞損傷中起到關(guān)鍵作用。NOS分為3種：誘導(dǎo)型、內(nèi)皮型、神經(jīng)元型。iNOS增加使生成的一氧化氮(NO)和氧自由基(O2-)過量，致胰島細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂而破壞其結(jié)構(gòu)與功能，發(fā)揮直接毒性效應(yīng)；另一方面細(xì)胞因子可通過誘導(dǎo)β細(xì)胞表達(dá)Fas受體，與細(xì)胞表達(dá)的FasL相互作用，使β細(xì)胞凋亡[6]。

細(xì)胞因子是導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡的效應(yīng)因子，iNOS及NO分泌在β細(xì)胞損傷中起到關(guān)鍵作用。IL-1作用于大鼠胰島細(xì)胞明顯抑制胰島素分泌并導(dǎo)致胰島破環(huán)，此作用可以被iNOS抑制劑預(yù)防。胰島是一個(gè)異質(zhì)群體，除內(nèi)分泌細(xì)胞外，還包含了約0.5%的組織巨噬細(xì)胞及其他比例的非內(nèi)分泌細(xì)胞。胰島內(nèi)巨噬細(xì)胞可能是IL-1之來源細(xì)胞?；罨木奘杉?xì)胞同時(shí)分泌iNOS和IL-1才能導(dǎo)致胰島細(xì)胞破壞，在僅有NO產(chǎn)生而缺乏IL-1時(shí)并不會(huì)影響β細(xì)胞功能[2]。巨噬細(xì)胞在克爾漢大鼠病毒(KRV)誘導(dǎo)BB大鼠發(fā)生自身免疫性糖尿病過程中起到關(guān)鍵性作用，其效應(yīng)的發(fā)揮主要是通過誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)及隨之增加的NO。而予氨基胍(AG)處理可以預(yù)防糖尿病發(fā)生，其作用一方面是眾所周知的抑制iNOS和NO產(chǎn)生，另一方面有助于維持免疫平衡[3]。

本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)的胰島N IT細(xì)胞中加入免疫破壞性細(xì)胞因子IL-1β及IFN-γ，導(dǎo)致NIT細(xì)胞分泌大量iNOS及NO，胰島素分泌減少。經(jīng)過AG預(yù)處理的N IT細(xì)胞，予IL-1β+IFN-γ破壞后，一氧化氮及iNOS分泌減少，其分泌水平與對(duì)照組無差異，但仍高于AG單獨(dú)作用組；同時(shí)，AG+IL-1β+IFN-γ處理組胰島素分泌較IL-1β+IFN-γ組增多，與對(duì)照組比較未見差異。提示AG可通過抑制NO及iNOS生成而減輕IL-1β+IFN-γ對(duì)N IT細(xì)胞的損傷作用，保護(hù)N IT細(xì)胞的胰島素分泌功能。

氨基胍是一種親核肼化物，可有效抑制細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外組分的非酶糖化及AGE產(chǎn)生。同時(shí)氨基胍也是被證實(shí)的第一個(gè)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抑制劑，對(duì)誘導(dǎo)型的抑制作用較內(nèi)皮型和神經(jīng)元型強(qiáng)40～50倍[7]。過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證實(shí)了氨基胍在預(yù)防及延緩NOD鼠發(fā)生自身免疫性糖尿病中發(fā)揮了重要作用[8]。對(duì)于糖尿病微血管病變，以氨基胍抑制AGE產(chǎn)生可以防止視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜變厚、周細(xì)胞數(shù)目減少及形態(tài)異常[9]。氨基胍作為選擇性iNOS抑制劑，可以增加ATP產(chǎn)生及胰島素分泌，延緩小鼠糖尿病發(fā)生[4]。那么對(duì)于體外培養(yǎng)的胰島細(xì)胞，是否具有直接的保護(hù)作用呢？李柏峰等[10]發(fā)現(xiàn)，iNOS在細(xì)胞因子誘導(dǎo)的大鼠胰島細(xì)胞凋亡中起到十分關(guān)鍵的作用，而氨基胍通過抑制iNOS活性，減輕細(xì)胞因子對(duì)大鼠胰島細(xì)胞的損害，降低了胰島凋亡水平，改善胰島的存活與功能。Koh等[11]發(fā)現(xiàn)，氨基胍減少2-脫氧-d-核糖所致胰島H IT-T15細(xì)胞內(nèi)氧自由基及AGEs產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)也觀察到了氨基胍通過抑制iNOS及NO生成而減輕細(xì)胞因子對(duì)N IT細(xì)胞的損傷作用，保護(hù)N IT細(xì)胞的胰島素分泌功能。若能從此方面入手，將為胰島功能的保護(hù)及糖尿病的預(yù)防與治療研究提供更多的選擇手段。

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