潘侃達(dá)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在適宜的誘導(dǎo)條件下能夠分化成為多種間質(zhì)組織，包括骨、脂肪、軟骨、心肌和骨骼肌細(xì)胞, 甚至還有神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞等[1-2]。越來越多的研究表明，干細(xì)胞所處的微環(huán)境對干細(xì)胞的分化與表型變化有著十分重要的影響，而這個微環(huán)境主要是由干細(xì)胞周圍的成體細(xì)胞所產(chǎn)生。大量胚胎學(xué)研究[3-4]結(jié)果表明造血系統(tǒng)祖細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞來源于共同的干細(xì)胞——間充質(zhì)干細(xì)胞，因此本論文擬通過研究血管組織抽提物對MSC分化的影響，證明血管內(nèi)皮細(xì)胞是否含有對MSC分化命運(yùn)決定的物質(zhì)組份。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠(浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心)、胎牛血清(杭州四季青生物技術(shù)有限公司)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco，含1.0g/L葡萄糖)、青霉素-鏈霉素雙抗(Hyclone)、淋巴細(xì)胞分離液(Gibco)、混合型膠原酶和胰蛋白酶(Gibco)、蛋白酶抑制劑(Amresco)、TrizolReagent(Invitrogen)、Taq DNA polymerase(Promega)，dNTPs(Promega)、M-MLV Reverse transcriptase(Invitrogen)、瓊脂粉、瓊脂糖、DNA marker(BBI)、DEPC(上海生物工程有限公司)。

1.2 大鼠MSCs的分離培養(yǎng)

戊巴比妥鈉(50mg/kg體重)腹腔注射麻醉SD大鼠，無菌操作剝離股骨、脛骨，剪去兩端干骺端以顯露骨髓腔。然后，以5mL含20%肝素的基礎(chǔ)培養(yǎng)液(10%胎牛血清和100U/mL青/鏈霉素的DMEM)反復(fù)沖洗骨髓腔，制成細(xì)胞混懸液。將細(xì)胞混懸液加入裝有等體積淋巴細(xì)胞分離液的離心管上層，600g離心20min，液體分成4層，收集中間交界面處乳白色的單個核細(xì)胞層，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并將其最終體積調(diào)為6mL，400g離心5min，棄去上清液，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液制備單個核細(xì)胞懸液并計數(shù)。將單個核細(xì)胞以1×105cells/ml細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后吸出未貼壁細(xì)胞懸液重新培養(yǎng)，培養(yǎng)基每3天換液1次，2周后待貼壁細(xì)胞達(dá)90%融合時以0.125%胰酶消化，按1：3傳代，定期取生長狀態(tài)細(xì)胞進(jìn)行倒置相差顯微鏡觀察。

1.3 血管組織細(xì)胞抽提物制備

無菌環(huán)境下取新鮮血管組織，用PBS沖洗三次，徹底去除表面附著物。然后剪碎，并在混合型膠原酶(0.5%)，37℃溫浴下消化6h；離心去掉上清，用胰酶(0.25%)再消化過夜；離心收集細(xì)胞沉淀，使用含蛋白酶抑制劑(1:100)細(xì)胞裂解液含重懸細(xì)胞，超聲破碎裂解細(xì)胞，然后4℃，14,000g離心15min，重復(fù)兩次。最后，將收集到的血管組織上清液在無菌條件下通過0.22um濾器過濾, 4℃冰箱保存待用。

1.4 大鼠MSCs的誘導(dǎo)分化

將第四代MSCs加入不同的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化，間隔2～3d換液1次，誘導(dǎo)培養(yǎng)7～14天。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液分別為：基礎(chǔ)培養(yǎng)液+基礎(chǔ)培養(yǎng)液(實(shí)驗(yàn)組1，體積數(shù)與其他兩組相等)、基礎(chǔ)培養(yǎng)液+熱處理血管組織上清液(實(shí)驗(yàn)組2，煮沸15min后置冰浴立即冷卻)、基礎(chǔ)培養(yǎng)液+血管組織上清液(實(shí)驗(yàn)組3)。另外，以相同條件培養(yǎng)原代血管內(nèi)皮細(xì)胞作為陽性對照，進(jìn)行特異性基因表達(dá)分析。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)融合成單層, 待細(xì)胞長滿瓶底的80%時用0.125%的胰酶消化, 進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞分化鑒定

RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)作為一種有效地檢測基因表達(dá)的方法被廣泛應(yīng)用。本論文采用該方法從mRNA水平檢測內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因是否表達(dá)，從而判斷MSCs是否向血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生分化。本論文所采用的引物序列見表1。擴(kuò)增條件按照正常PCR進(jìn)行。

表1 內(nèi)皮細(xì)胞特征性基因檢測特異性引物Table 1 The primers of the specific genes in the endothelial cells

2 研究結(jié)果

2.1 大鼠MSCs表面形態(tài)學(xué)及表面抗原檢測

倒置顯微鏡下觀察傳代培養(yǎng)的大鼠MSCs呈扁平狀或多角形，生長旺盛時呈旋渦樣。隨著細(xì)胞密度的增加，胞體變得細(xì)長，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞(見圖1A)。傳代至第四代(Progenitor 4,P4)后，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)，結(jié)果表明MSC表面抗原細(xì)胞CD73、CD90表達(dá)陽性,而CD34為陰性表達(dá),說明P4代的細(xì)胞呈比較“純化”的MSC(見圖1B)。

2.2 誘導(dǎo)分化后細(xì)胞表面形態(tài)學(xué)觀察

誘導(dǎo)培養(yǎng)后，三個實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞表面形態(tài)基本沒有發(fā)生顯著變化，均生長旺盛。但是，隨著傳代次數(shù)的增加，扁平細(xì)胞增加，細(xì)胞呈現(xiàn)衰老狀態(tài)。

圖1 大鼠MSCs表面形態(tài)學(xué)觀察以及細(xì)胞表面抗原檢測

2.3 誘導(dǎo)分化后內(nèi)皮細(xì)胞特征性基因表達(dá)檢測

取誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后2周細(xì)胞，分別提取RNA，并采用RTPCR檢測內(nèi)皮細(xì)胞特征性基因表達(dá)情況，結(jié)果表明添加血管組織上清液的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組與原代培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，均能檢測到CD31、CD33、CD144以及一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)的表達(dá)，而未加血管組織上清液的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組和添加熱處理血管組織上清液的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)均無相關(guān)基因表達(dá)或表達(dá)量很低(見圖2)。

3 討論

圖2 MSCs誘導(dǎo)分化后內(nèi)皮細(xì)胞特征性基因表達(dá)檢測

組織工程是近年來發(fā)展的熱點(diǎn)，間充質(zhì)干細(xì)胞是目前最常用的種子細(xì)胞。許多研究[5-7]表明骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能在局部微環(huán)境影響下重新編程，在體外定向分化為不同類型的細(xì)胞,如成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等。這些結(jié)果表明細(xì)胞外基質(zhì)成份對干細(xì)胞的命運(yùn)具有決定性作用。但是，本研究通過在含內(nèi)皮細(xì)胞抽提物的誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，使其在培養(yǎng)兩周后表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物，證明MSCs的分化方向不僅與細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境密切相關(guān)，而且也受所處環(huán)境成體細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)因子的影響，分離鑒別這些誘導(dǎo)因子，對于間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)一步在臨床上的運(yùn)用具有重要的意義。

細(xì)胞表面分子是多種細(xì)胞分化和定型的標(biāo)志。一般認(rèn)為，MSCs不表達(dá)分化相關(guān)的標(biāo)志，如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原或堿性磷酸酶等，在細(xì)胞貼壁附著后，細(xì)胞均一致表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105、CD120a和CD124等多種表面蛋白[8-9]。但目前對MSCs表面特異性標(biāo)志物的認(rèn)識，尚存在不同觀點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選擇CD90、CD73作為MSCs的特征性表面分子進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

血管內(nèi)皮細(xì)胞普遍公認(rèn)的特異性標(biāo)志物包括CD31、CD34、CD144以及一氧化氮合酶等[10-11]。本研究通過膠原酶與胰酶的處理，徹底去除細(xì)胞外基質(zhì)成份。然后裂解內(nèi)皮細(xì)胞使其內(nèi)容物外露，從而可以直接與間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合，成功地誘導(dǎo)其分化為可表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，驗(yàn)證了MSCs的多向分化潛能，也說明干細(xì)胞的分化機(jī)制和誘導(dǎo)條件很復(fù)雜，可受到很多因素的影響。此外，在圖2中，可以看出熱處理血管組織上清液誘導(dǎo)MSCs分化培養(yǎng)后，CD31和CD34也有痕量表達(dá)，這可能是由于血管組織抽提物內(nèi)含有非蛋白質(zhì)誘導(dǎo)因子或者是蛋白因子變性不徹底，從而使MSCs發(fā)生部分分化造成的。

總之，利用BMSCs可誘導(dǎo)出具有血管內(nèi)皮細(xì)胞特性的細(xì)胞，該細(xì)胞可在體外繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增，可作為構(gòu)建組織工程化血管的種子細(xì)胞。

[1]Satija NK,Singh VK,Verma YK,et al.Mesenchymal Stem Cell-based Therapy:A New Paradigm in Regenerative Medicine[J].J Cell Mol Med,2009 Jul 10.[Epub ahead of print].

[2]裴瑛波.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)和定向分化的研究現(xiàn)狀[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(13):2775-2778.

[3]Hirashima M,Kataoka H,Nishikawa S,et al.Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis[J].Blood,1999,93(4):1253-1263.

[4]Young PP,Vaughan DE,Hatzopoulos AK.Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy[J].Prog Cardiovasc Dis,2007,49(6):421-429.

[5]Lozito TP,Taboas JM,Kuo CK,et al.Mesenchymal stem cell modification of endothelial matrix regulates their vascular differentiation[J].J Cell Biochem,2009,107(4):706-713.

[6]Oswald J,Boxberger S,J rgensen B,et al.Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro[J].Stem Cells,2004,22(3):377-384.

[7]郭尚春,陳欣,袁霆,等.誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2009,29:154-157.

[8]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5411):143-147.

[9]Turnovcova K,Ruzickova K,Vanecek V,et al.Properties and growth of human bone marrow mesenchymal stromal cells cultivated in different media[J].Cytotherapy,2009,25:1-12.

[10]Hristov M,Schmitz S,Schuhmann C,et al.An optimized flow cytometry protocol for analysis of angiogenic monocytes and endothelial progenitor cells in peripheral blood[J].Cytometry A,2009,75A(10):848-853.

[11]晏開力,汪健,李慶,等.成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志,2007,21(1):76-80.