陳 煜,楊燕凌,謝小芳,肖西志

(1.福建農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002;2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東青島 266002;3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊陵 712100)

銅綠假單胞菌抗體制備及抑菌作用*

陳 煜1,楊燕凌1,謝小芳1,肖西志2,3*

(1.福建農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002;2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東青島 266002;3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊陵 712100)

研究銅綠假單胞菌抗體對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的抑制作用。制備兔抗銅綠假單胞菌抗體,純化后加入液體和固體培養(yǎng)基中,接種沙門(mén)菌和銅綠假單胞菌混合物,對(duì)沙門(mén)菌進(jìn)行選擇分離。試驗(yàn)表明,添加抗體后能夠成功抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng),而不影響沙門(mén)菌的分離。將200 μ L和400 μ L銅綠假單胞菌抗體添加入相應(yīng)培養(yǎng)基中,能夠抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng),而達(dá)到篩選沙門(mén)菌的目的。

銅綠假單胞菌;抗體;培養(yǎng)基;抑菌作用

銅綠假單胞菌形態(tài)為直或稍彎、兩端鈍圓的桿菌,革蘭氏染色陰性,專性需氧。在自然界分布廣泛,為土壤中存在的最常見(jiàn)的細(xì)菌之一,也是臨床上的機(jī)會(huì)性致病菌之一。各種水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有本菌存在。本菌最適生長(zhǎng)溫度35℃,在41℃也能生長(zhǎng)。雖然在動(dòng)物性飼料檢測(cè)項(xiàng)目中不包括銅綠假單胞菌,但它的存在會(huì)對(duì)沙門(mén)菌的檢測(cè)造成干擾,特別是在一些顯色培養(yǎng)基中,銅綠假單胞菌與沙門(mén)菌表現(xiàn)出同樣的菌落顏色。因此,研究能抑制銅綠假單胞菌檢出的培養(yǎng)基將有助于沙門(mén)菌的檢測(cè)和鑒定,減少工作量。將抗體添加到培養(yǎng)基中研究其體外抗菌作用是臨床細(xì)菌性疾病的免疫治療的方法之一[1-2],同時(shí)也應(yīng)用于抑制口腔中變形桿菌的黏附[3-4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 銅綠假單胞菌由山東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中心分離并保存;鼠傷寒沙門(mén)菌(IQCC10503)由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院食品所饋贈(zèng);陰溝腸桿菌為本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.1.2 試驗(yàn)用動(dòng)物 新西蘭大白兔購(gòu)自青島市食品藥品監(jiān)察所。

1.1.3 主要試劑和儀器 VITEK GN鑒定卡,為法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品;亞烯酸鹽胱氨酸肉湯(SC)、氯化鎂孔雀綠肉湯(MM)北京陸橋公司產(chǎn)品;營(yíng)養(yǎng)瓊脂,均為OXOID公司產(chǎn)品;硫酸銨,為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;PICODROP分光光度計(jì)(型號(hào):PICOPET01),VITEK微生物鑒定系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的制備 將銅綠假單胞菌接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,37℃,24 h,刮取培養(yǎng)物,溶于生理鹽水中,充分溶解后分裝到滅菌小試管內(nèi),每管5 mL,分裝 4管。分別加入甲醛溶液 5、10、20、40 μ L,37 ℃下作用1 h后,分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,檢測(cè)滅活效果。取無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最小稀釋度作為免疫原。

1.2.2 免疫原蛋白含量的檢測(cè) 將制備的免疫原吸取2 μ L在PICODROP分光光度計(jì)上進(jìn)行蛋白含量檢測(cè)。

1.2.3 免疫接種 用滅活的免疫原接種4只新西蘭大白兔,于初免后14 d進(jìn)行二免,二免后30 d后加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫后1周內(nèi)采血,分離血清,AGD法測(cè)抗體效價(jià)。

1.2.4 抗體純化 采用飽和硫酸銨法對(duì)分離的兔血清進(jìn)行純化,具體操作按文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。

1.2.5 抑菌試驗(yàn)的抗體用量的確定 分別取純化的抗體 25、50、100、200 μ L 接種于滅菌的10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中,然后往營(yíng)養(yǎng)肉湯中加入100 μ L銅綠假單胞菌菌液100 μ L(1×109cfu),37 ℃培養(yǎng)24 h。用培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)肉湯接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.6 液體培養(yǎng)基中的抑菌試驗(yàn) 分別取100、200、400、800、1 600 μ L 的 1.2.5 中確定的抗體用量加入到5瓶滅菌的SC培養(yǎng)基中(100 mL),另外2瓶SC作為對(duì)照,即只接種1×109cfu的銅綠假單胞菌菌液,37℃,24 h后接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂和沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基;分別取 100、200、400 μ L 的 1.2.5 中確定的稀釋度抗體加入到滅菌的裝有MM的試管中(10 mL),另外2管作為對(duì)照,即只接種 100 μ L 1×109cfu的銅綠假單胞菌菌液,然后再加入 100 μ L 1×109cfu的銅綠假單胞菌菌液,42℃,24 h后接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂和沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基[6]。

1.2.7 固體培養(yǎng)基中的抑菌試驗(yàn) 取100、200、400、800、1 600 μ L銅綠假單胞菌抗體與沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基(50℃～60℃)混合,然后倒平板,接種銅綠假單胞菌,設(shè)置2個(gè)對(duì)照,即不加抗體的銅綠假單胞菌菌液直接接種沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基,37℃,24 h后觀察結(jié)果。

1.2.8 沙門(mén)菌的選擇分離 取100 μ L銅綠假單胞菌抗體與100 μ L銅綠假單胞菌,然后將沙門(mén)菌菌液100 μ L同上述的混合液一起接種SC和MM,24 h后,將培養(yǎng)物接種沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基,37℃,12 h～24 h;將陰溝腸桿菌作為對(duì)照,接種于含有銅綠假單胞菌和抗體的培養(yǎng)基中。將分離的菌落進(jìn)行純培養(yǎng)后用VITEK鑒定系統(tǒng)鑒定。

1.2.9 VITEK鑒定 將1.2.8中的分離的單菌落純培養(yǎng)后用VITEK GN(革蘭陰性鑒定卡)鑒定。

1.2.10 模擬試驗(yàn) 將銅綠假單胞菌和沙門(mén)菌分別摻到經(jīng)高壓滅菌的魚(yú)飼料、牛肉骨粉中,放入干燥箱中,37℃干燥。干燥后取25 g接種BPW(緩沖蛋白胨水),37℃,24 h。增菌后接種于含有銅綠假單胞菌抗體的SC和MM培養(yǎng)基中,抗體接種量為50、100、200、400 μ L。 SC,37 ℃,24 h;MM,42 ℃,24 h[7]。然后將SC、MM 的增菌液接種沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基,37℃,12 h～24 h。將分離的單菌落純培養(yǎng)后,用VITEK鑒定儀鑒定。

2 結(jié)果

2.1 免疫原的制備

經(jīng)無(wú)菌檢測(cè),向銅綠假單胞菌菌液中加甲醛至20 μ L時(shí) ,無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.2 免疫原的檢測(cè)

滅活的銅綠假單胞菌菌液經(jīng)PICODROP分光光度計(jì)檢測(cè),含量為10.65 mg/mL。

2.3 抗體效價(jià)測(cè)定

使用AGD法,所分離的血清效價(jià)為1∶64。按文獻(xiàn)[5]方法,用飽和硫酸銨法純化抗體。

2.4 抗體用量的確定

接種營(yíng)養(yǎng)肉湯,37℃,24 h后,抗體接種為100 μ L和 200 μ L 時(shí) ,營(yíng)養(yǎng)肉湯中明顯有白色沉淀,培養(yǎng)液清亮;而接種抗體 25 μ L和50 μ L 的營(yíng)養(yǎng)肉湯試管內(nèi)培養(yǎng)液為渾濁。將上述培養(yǎng)液接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板后 ,接種 25 μ L 和 50 μ L 抗體的營(yíng)養(yǎng)肉湯有細(xì)菌生長(zhǎng),而接種為100 μ L 和 200 μ L 抗體的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物無(wú)菌落生長(zhǎng),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 接種營(yíng)養(yǎng)肉湯后銅綠假單胞菌抗體用量Table 1 Confirmation of the P.Aeruginosa antibody doses in broth after inoculating P.aerugilnosa

2.5 液體培養(yǎng)基的抑菌試驗(yàn)

當(dāng)抗體接種量為1 600 μ L時(shí),SC培養(yǎng)基中不能分離到銅綠假單胞菌菌;當(dāng)抗體接種量為100 μ L時(shí),MM培養(yǎng)基中不能分離到銅綠假單胞菌。

2.6 固體培養(yǎng)基的抑菌試驗(yàn)

對(duì)照組生長(zhǎng)出紫色菌落,試驗(yàn)組中全部有紫色菌落,但菌落數(shù)比對(duì)照組少,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 銅綠假單胞菌抗體與沙門(mén)菌固體培養(yǎng)基的抑菌試驗(yàn)Table 2 Antibacterial assay of P.aeruginosa antibody and S.salmonella solid media

2.7 沙門(mén)菌選擇分離

1.2.8中沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基上長(zhǎng)出紫色菌落。純培養(yǎng)物用VITEK GN鑒定卡進(jìn)行鑒定,表明實(shí)驗(yàn)組中分離的細(xì)菌經(jīng)鑒定為沙門(mén)菌,對(duì)照組為陰溝腸桿菌。

2.8 模擬試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)VITEK 鑒定,50 μ L 和100 μ L 抗體接種的平板長(zhǎng)出沙門(mén)菌和銅綠假單胞菌,而接種200 μ L,400 μ L抗體的的只有沙門(mén)菌生長(zhǎng),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3模擬試驗(yàn)Table 3 Mimicry assay

3 討論

為了提高培養(yǎng)基的選擇性,目前有以下幾種方法:①在培養(yǎng)基中添加抗生素,該方案應(yīng)用于基因工程中重組子的篩選,如在 LB培養(yǎng)基中加入卡那霉素,可以將插入了外源基因的大腸埃希菌篩選出來(lái);②在培養(yǎng)基中添加呋喃類抑菌物質(zhì)[8];③喹諾酮類[9];④小分子肽[10];⑤利用酶催化反應(yīng),在培養(yǎng)基中加入酶的底物,產(chǎn)這種酶的細(xì)菌將在培養(yǎng)基中顯示相應(yīng)的顏色,這也是當(dāng)前顯色培養(yǎng)基生產(chǎn)所采用的方法。目前,還沒(méi)有將相應(yīng)抗體加入培養(yǎng)基來(lái)提高培養(yǎng)基選擇性的研究。

沙門(mén)菌是進(jìn)出口動(dòng)物性飼料的法檢項(xiàng)目之一,通常存在于未經(jīng)加熱處理的牛羊肉骨粉中,而白魚(yú)粉、紅魚(yú)粉等經(jīng)過(guò)熱處理的飼料中沙門(mén)菌較少。但存在于其中的腸桿菌科其他細(xì)菌在沙門(mén)菌的檢測(cè)中常能引起干擾,給沙門(mén)菌的分離、鑒定工作帶來(lái)很大麻煩。目前沙門(mén)菌的檢測(cè)首先是用BPW進(jìn)行預(yù)增菌,然后經(jīng)SC和MM 進(jìn)行選擇性增菌,最后經(jīng)選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離。為了加快沙門(mén)菌的分離,一些公司利用沙門(mén)菌的特異酶開(kāi)發(fā)了沙門(mén)菌的顯色培養(yǎng)基,通過(guò)所分離細(xì)菌的菌落顏色來(lái)判斷是否為沙門(mén)菌。但通過(guò)大量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),這些培養(yǎng)基對(duì)沙門(mén)菌的分離并不具有特異性,一些細(xì)菌的菌落與沙門(mén)菌的菌落顏色相同,即也為紫色,銅綠假單胞菌菌即為其中之一。為了提高培養(yǎng)基的選擇性,加快沙門(mén)菌的分離鑒定,我們通過(guò)向培養(yǎng)基中添加銅綠假單胞菌的抗體,來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng),從而排除沙門(mén)菌分離過(guò)程中銅綠假單胞菌造成的干擾。

本研究結(jié)果顯示,在液體培養(yǎng)基中添加銅綠假單胞菌的抗體能夠抑制該菌的生長(zhǎng),而且不影響沙門(mén)菌的分離。但在固體培養(yǎng)基中的效果卻不如液體培養(yǎng)基效果好,并不能完全抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng),當(dāng)添加抗體量較大時(shí)才會(huì)稍出現(xiàn)輕微的抑制,估計(jì)這與抗體作用的發(fā)揮主要是在液體環(huán)境中有關(guān),另外一個(gè)原因可能是菌體在固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng),存在于培養(yǎng)基中的抗體與菌體的結(jié)合沒(méi)有液體中那樣充分,也就不能發(fā)揮其抑菌作用。

雖然沙門(mén)菌的鑒定方法很多,如PCR方法,這些方法具有快速、成本低等有點(diǎn),但沙門(mén)菌檢測(cè)方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”仍是細(xì)菌分離、鑒定,盡管細(xì)菌的分離鑒定工作耗時(shí)長(zhǎng)、成本高,但通過(guò)兩步增菌能夠使存在于檢測(cè)樣品中的沙門(mén)菌大量增加,為后面的鑒定提供了足夠數(shù)量的“模版”。

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Antibody Preparation ofP.aeruginosaand Research on Antibacterial Effect

CHEN Yu1,YANG Yan-ling1,XIE Xiao-fang1,XIAO Xi-zhi2,3

(1.College of Li fe Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian,350002,China;2.Shandong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao,Shandong,266002,China;3.College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi,712100,China)

To investigate the growth inhibition ofP.aeruginosathrough adding its antibody into media and accomplish the screening ofS.salmonella.The antibody ofP.aeruginosawere prepared and added into liquid and solid media after purification.S.salmonellaandP.aeruginosawere inoculated into the media and the cultures were evaluated.The growth ofP.aeruginosawas inhibited when its antibody was added into media,whereas the growth ofS.salmonellawas not.The growth ofP.aeruginosawas inhibited when its antibody was added into media and resulted in the screening ofS.salmonella.

P.aeruginosa;antibody;antibacterial effect;medium

S852.614

A

1007-5038(2010)08-0038-04

2009-12-25

山東出入境檢驗(yàn)檢疫局科技項(xiàng)目(SK200809)

陳 煜(1977-),女,四川瀘州人,講師,主要從事分子生物學(xué)的教學(xué)和科研工作。*通訊作者