楊旭芳 趙永光 楊云芳

(牡丹江醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,黑龍江 牡丹江 157011)

糖尿病微血管病變所致的糖尿病腦病(diabetic encephalopathy,DE)主要表現(xiàn)為認(rèn)知障礙,即記憶力減退、分析解決問題的能力與學(xué)習(xí)能力均下降。關(guān)于 DE的預(yù)防與治療,還未找到可靠有效的藥物,目前對心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用的傳統(tǒng)中藥銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract,EGb)對DE的預(yù)防及其對腦組織的保護(hù)作用少有報道,故本研究應(yīng)用鏈脲佐菌素(STZ)建立大鼠糖尿病(DM)模型,觀察EGb對實驗性DM大鼠血糖、血胰島素、血漿內(nèi)皮素(ET)及腦組織中 ET含量變化及治療前后腦組織內(nèi) ET表達(dá)的影響,旨在探討 EGb對 DM大鼠腦損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 EGb購自北京雙鶴天然藥物有限公司,血糖試劑盒購自南京建成生物研究所。胰島素、ET放免分析試劑盒購自中國人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所。STZ購自華美生物工程公司北京分公司。

1.2 動物及分組 選用 Wistar大鼠 40只,由本院動物室提供,雌雄各半,體重 200～250 g,大鼠禁食 16～18 h,自由飲水,隨機(jī)取 30只經(jīng)尾靜脈注射 STZ(30 mg/kg),2 w后,做葡萄糖耐量實驗(OGTT),篩選糖耐量異常者共 22只喂以高熱量飲食,隨機(jī)分為DM組和EGb,每組 11只。治療組按 8 mg/kg劑量腹腔注射 EGb,1次/d;DM組大鼠每日腹腔注射同體積生理鹽水;另 10只大鼠以普通飼料喂養(yǎng),作為正常對照組,亦每日腹腔注射同體積生理鹽水。三組均連續(xù)注射 8w。

1.3 血液樣本的采集 大鼠空腹在乙醚麻醉下,內(nèi)眥靜脈取血約 6 ml,2 000 r/min離心 15 min,取分離血清貯存于 -20℃冰箱中,用于測定血清葡萄糖、胰島素、ET。

1.4 腦組織勻漿的制備 取部分腦組織,用預(yù)冷生理鹽水反復(fù)蕩洗 3次,濾紙吸干,稱重后置于玻璃勻漿器中,用冷凍處理的生理鹽水將此標(biāo)本制成 1∶10的組織勻漿,4 000～6 000 r/min離心 15 min,取上清液備用。

1.5 腦組織 ET mRNA表達(dá)的檢測 把預(yù)留的腦組織快從-70℃冰箱中取出,取合適大小的組織快,放入預(yù)先用液氮預(yù)冷的研缽中研磨組織,加入 500μl Trizol,使其充分裂解,分別從三組中抽提總 RNA,RT-PCR檢測 ET的表達(dá)。引物序列為ET:正義 5′-TTTTCCCTCCTCTTCTTCTGAT-3′;反義 5′-ACTTCTTGTCTTTTTGGTGAGC-3′;β-actin:正 義 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′;反 義 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。 并利用圖像分析軟件(IDImage Analysis Software)分析PCR產(chǎn)物/β-actin灰度比值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)用x±s表示,組間差異的顯著性用 t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 EGb對DM大鼠血糖的影響 實驗 10 w時,DM組大鼠表現(xiàn)出糖耐量異常的變化(P＜0.05),1 h血糖增高顯著(P＜0.01)達(dá)高峰,2 h血糖仍較高;正常對照組大鼠 30 min血糖達(dá)到峰值,2 h血糖基本恢復(fù)正常。10 w時治療組則表現(xiàn)出糖耐量異常有明顯改善。見表 1。

表1 實驗 10w時血清葡萄糖水平(mmol/L,x±s)

2.2 血清胰島素水平的改變 實驗結(jié)束測定三組大鼠胰島素水平,DM組高于對照組 〔(50.90±13.63)vs(34.11±5.82)μU/ml〕(P＜0.01),經(jīng) EGb治 療后,胰島素水平〔(40.96±6.41)μU/ml〕顯著下降(P＜0.05),見表 2。

2.3 血漿及腦組織ET含量的測定 DM組大鼠血漿及腦中ET含量高于對照組(P＜0.01),經(jīng) EGb治療后,血漿及腦中 ET含量則低于 DM組(P＜0.05)。見表 2。

表2 實驗 10w時血漿與腦組織中 ET含量比較(x±s,pg/ml)

2.4 腦組織ET mRNA的表達(dá) RT-PCR檢測結(jié)果顯示,三組均見 ET mRNA表達(dá),正常組 ET/β-actin為 0.426±0.002,DM組為 2.402±0.001,治療組為 1.102±0.001,治療組 ET mRNA表達(dá)較 DM組明顯下調(diào)。見圖 1。

圖1 RT-PCR檢測ET mRNA的表達(dá)

3 討 論

EGb是目前國內(nèi)外藥物治療缺血性心腦血管病中的常用藥物,其有效成分主要為銀杏黃酮苷類和萜烯內(nèi)酯類生物活性物質(zhì),具有清除氧自由基、抑制 NO的產(chǎn)生等作用〔1〕,還能舒張血管平滑肌、降低外周血流阻力、增加局部血流量、改善心腦等器官血液循環(huán)〔2,3〕。

DE是由于 DM糖代謝紊亂導(dǎo)致腦血管改變,損害中樞神經(jīng)系統(tǒng),使大腦在結(jié)構(gòu)、神經(jīng)生理及精神等方面發(fā)生病理改變,以獲得性認(rèn)知行為缺陷為特征的 DM慢性并發(fā)癥〔4,5〕,有關(guān)DM腦神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制尚未明確,但一般認(rèn)為與高血糖引起的代謝紊亂、氧自由基的作用以及血管內(nèi)皮功能異常,促進(jìn)ET的釋放,最終導(dǎo)致血管舒張功能受損有關(guān)〔6〕。ET主要由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生,是血管內(nèi)皮損傷的標(biāo)記物,也是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)大、持續(xù)時間最長的血管收縮肽。

EGb具有顯著的降糖、降低血漿胰島素水平、清除氧自由基作用,本實驗前期結(jié)果已闡述了EGb降糖、胰島素、抗氧化應(yīng)激的可能機(jī)制與其對胰島的修復(fù)及清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)〔7〕,本次結(jié)果顯示實驗性 DM大鼠血漿及腦組織內(nèi)ET的含量較對照組顯著升高,這與戴自英等報道一致〔6〕。但經(jīng) EGb治療后,ET水平明顯下降,且腦組織內(nèi) ET mRNA水平表達(dá)下調(diào),提示EGb降低ET的作用是通過抑制 ET基因表達(dá)實現(xiàn)的,具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑目前還不清楚,這將是下一步的研究目標(biāo),將為充分利用 EGb,開發(fā)一類用于預(yù)防和治療 DM以及 DE的有效制劑提供依據(jù)。

1 La Casa C,Villegas L,Alarcon de la Lastra C,et al.Evidence for protective and antioxidant properties of rutin,a natural flavone,against ethanol induced gastric lesions〔J〕.JEthnopharmacol,2000;71(1-2):45-53.

2 Kubota Y,Tanaka N,Umegaki K,et al.Ginkgo biloba extract-induced relaxation of rat aortais associated with increase in endothelial intracellular calcium level〔J〕.Life Sci,2001;69(20):2327-36.

3 Nishida S,Satoh H.Comparative vasodilating actions among terpenoids and flavonoids contained in Ginkgo biloba extract〔J〕.Clin Chim Acta,2004;339(1-2):129-33.

4 田國慶,梁曉春.糖尿病性腦病〔J〕.中國康復(fù)理論與實踐,2003;9(10):635-6.

5 Biessels Gj,van der Heide LP,Kamnal A,et al.Ageing and diabetes:implications for brain function〔J〕.Eur J Pharmacol,2002;441(1-2):1-14.

6 戴自英,陳灝珠.實用內(nèi)科學(xué)〔M〕.第 11版 .北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:953.

7 鄒 輝,楊旭芳,郭尚福 .銀杏葉提取物對實驗性 2型糖尿病大鼠心肌的保護(hù)作用〔J〕.牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007;28(6):9-11.