周 平 李法琦 張 彬 常曉東 甘 華 陳力學(xué)

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科,重慶 400016)

高脂血癥可誘發(fā)、加重心肌缺血再灌注引起心肌細(xì)胞凋亡〔1〕,心肌細(xì)胞凋亡在心肌重構(gòu)及心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)作為細(xì)胞凋亡的新機(jī)制,參與心肌肥厚合并心力衰竭的心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程〔2〕,我們推測(cè) ERS也可能參與高脂血癥導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡的過(guò)程。辛伐他汀不僅通過(guò)調(diào)脂和穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊在心腦血管病防治中發(fā)揮重要的作用,而且通過(guò)激活一氧化氮合酶和磷脂酰肌醇 3-激酶-蛋白激酶 B(PI3-K/Akt)細(xì)胞的信號(hào)途徑發(fā)揮調(diào)脂外心臟保護(hù)作用〔3～5〕,但辛伐他汀能否通過(guò)調(diào)節(jié) ERS抑制高脂血癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡還未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道。本研究建立高脂血癥大鼠模型,觀察心肌細(xì)胞凋亡和ERS信號(hào)通路分子——葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78的表達(dá)并采用辛伐他汀進(jìn)行干預(yù),探討辛伐他汀對(duì)高脂血癥大鼠 ERS相關(guān)心肌細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性 Wistar大鼠 24只,4周齡,體重 200～250g。高脂飼料配方為:2%膽固醇、10%豬油、0.5%膽鹽、5%蛋黃、0.2%的丙硫氧嘧啶、82.3%基礎(chǔ)飼料。動(dòng)物及基礎(chǔ)飼料均由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥品與試劑 辛伐他汀(舒降之)購(gòu)自杭州默沙東公司,兔抗大鼠 GRP78抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,SABC免疫組化試劑盒、TUNEL試劑盒購(gòu)自武漢博士德,RT-PCR試劑盒購(gòu)自 TaKaRa公司;其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立與分組 普通飼料分籠飼養(yǎng) 1 w適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件后,大鼠隨機(jī)分成 3組,每組 8只:①正常對(duì)照組:普通飼料喂養(yǎng);②高脂血癥組:高脂飼料喂養(yǎng);③辛伐他汀組:在高脂飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上給予辛伐他汀 10 mg?kg-1?d-1灌胃,持續(xù) 12w。

1.3.2 標(biāo)本采集 12w時(shí),取各組大鼠的尾靜脈血,使用全自動(dòng)化生化儀檢測(cè)血清中膽固醇(TC)及甘油三酯(TG)含量。確定造模成功后,斷髓法處死動(dòng)物,消毒大鼠胸部,開(kāi)胸腔迅速取出心臟,沿室間隔分離左心室,沿左心室最寬處垂直于長(zhǎng)軸留取的心肌組織一部分置于 4%多聚甲醛固定,另取 0.5 g心肌組織于 EP管中置于液氮保存,待提取總 RNA,剩余心肌組織置 -80℃冰箱保存。

1.3.3 心肌組織的病理學(xué)檢測(cè) 4%多聚甲醛固定標(biāo)本,常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片(4μm)后,行 HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織的病理學(xué)改變。

1.3.4 心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè) TUNEL法檢測(cè)心肌組織的心肌細(xì)胞凋亡,操作步驟嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。光鏡下正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色,凋亡心肌細(xì)胞核呈棕黃色。每一切片選取 5個(gè)視野,在 200倍高倍鏡下,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),并計(jì)算凋亡指數(shù)(CAI)。CAI=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.3.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)心肌組織中 GRP78的表達(dá) 切片常規(guī)脫蠟至水,微波修復(fù)抗原,用 1∶1 000稀釋的兔抗大鼠GRP78抗體孵育,在4℃條件下過(guò)夜。PBS沖洗后滴加羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化酶,作用 30 min。DAB顯色,復(fù)染后封片。細(xì)胞質(zhì)著棕黃色者為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞,細(xì)胞質(zhì)無(wú)棕色或與背景色一致者為陰性。

1.3.6 RT-PCR法檢測(cè)心肌組織GRP78基因的表達(dá)水平 應(yīng)用上 游引物 5′-AGTGGTGGCCACTAATGGAG-3′、下 游引物 5′-CATGGTAGAGCGGAACAGGT-3′,擴(kuò)增 GRP78編碼的基因,預(yù)計(jì)產(chǎn)物的長(zhǎng)度為 289 bp。擴(kuò)增 β-actin的引物為:上游 5′-AGTGGTGGCACTAATGGAG-3′,下游 5′-TCTTTT-GTCAGGGGTCGTTC-3′,預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 696 bp。 PCR的反應(yīng)條件為:94℃3 min,94℃ 40 s,55℃ 40 s,72℃ 1 min,35個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包,數(shù)據(jù)以 x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較應(yīng)用 q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 血脂水平的變化 與正常對(duì)照組比較,高脂血癥組大鼠血清 TC和TG水平均顯著升高(P＜0.01);與高脂血癥組比較,辛伐他汀組大鼠血清 TC和 TG水平明顯降低但仍高于正常對(duì)照組,其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表 1。

表1 大鼠血清 TC、TG水平(x±s,mmol/L,n=8)

2.2 心肌組織病理學(xué)的改變 光鏡下可見(jiàn)正常對(duì)照組心肌細(xì)胞排列規(guī)則、心肌細(xì)胞邊界清晰、細(xì)胞核完整;高脂血癥組心肌細(xì)胞排列紊亂、邊界不清、心肌纖維斷裂、部分細(xì)胞核溶解消失;辛伐他汀組心肌纖維排列稍疏、細(xì)胞核溶解較少,心肌損傷程度介于正常對(duì)照組與高脂血癥組之間。見(jiàn)圖 1。

2.3 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 正常對(duì)照組偶見(jiàn)心肌細(xì)胞凋亡,心肌細(xì)胞 CAI為(2.6±0.25)%,高脂血癥組心肌細(xì)胞 CAI為(38.37±0.65)%,高于正常對(duì)照組(P＜0.05),辛伐他汀組心肌細(xì)胞 CAI為(14.57±0.27)%,低于高脂血癥組(P＜0.05)但仍高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)圖 2。

2.4 心肌組織GRP78蛋白表達(dá)水平 免疫組化結(jié)果顯示,正常對(duì)照組心肌 GRP78有微量表達(dá),平均光密度值為(0.052±0.013,n=8);高脂血癥組GRP78蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),胞漿內(nèi)充滿棕黃色顆粒,平均光密度值(0.232±0.030,n=8)明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05);辛伐他汀組GRP78蛋白呈弱陽(yáng)性表達(dá),平均光密度值(0.145±0.016,n=8)明顯低于高脂血癥組。見(jiàn)圖 3。

2.5 心肌組織 GRP78基因的表達(dá)水平 正常對(duì)照組 GRP78 mRNA表達(dá)較低,其平均灰度值為(0.192±0.004,n=8)。高脂血癥組GRP78mRNA的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),其平均灰度值為(0.784±0.024,n=8);與高脂血癥組比較,辛伐他汀組 GRP78 mRNA的表達(dá)明顯減少(0.421±0.012,n=8)但仍高于正常對(duì)照組,均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均 ＜0.05)。見(jiàn)圖 4。

圖1 12 w時(shí)各組大鼠心肌病理改變(HE,×400)

圖2 TUNEL法檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡(DAB,×200)

圖4 RT-PCR檢測(cè)各組大鼠心肌組織GRP 78的表達(dá)水平

3 討 論

高脂血癥是一種常見(jiàn)的血脂代謝紊亂,且是心腦血管疾病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一,其發(fā)病率逐年上升。研究發(fā)現(xiàn),高血脂可以激活內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞,導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生大量的自由基,從而引起心肌細(xì)胞的功能障礙甚至心肌細(xì)胞損傷〔6,7〕;高脂血癥也可以通過(guò)降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達(dá)使一氧化氮合成減少,從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷〔8〕。臨床研究也發(fā)現(xiàn),血液中高脂肪酸含量能夠降低心肌細(xì)胞的葡萄糖代謝及心肌對(duì)缺氧的耐受性〔9〕。本文在高脂血癥大鼠模型中發(fā)現(xiàn),高脂血癥組大鼠血清TC和 TG水平顯著增高的同時(shí),其心肌組織發(fā)生結(jié)構(gòu)紊亂且心肌細(xì)胞凋亡顯著增加,提示高脂血癥具有直接的心肌細(xì)胞毒性,可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞和心肌組織的結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成后折疊與聚集、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的細(xì)胞器。ERS是由某種原因?qū)е碌膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂的一種亞細(xì)胞器病理過(guò)程,可加強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蓄積在網(wǎng)腔內(nèi)的錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)的處理,有利于維持細(xì)胞的正常功能并使之存活,但長(zhǎng)時(shí)間的ERS可引起細(xì)胞凋亡〔10〕。由 ERS誘發(fā)的細(xì)胞凋亡有 3種細(xì)胞信號(hào)途徑:①CHOP/GADD153基因激活轉(zhuǎn)錄途徑;②JNK激活途徑;③內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的半胱氨酸蛋白酶 caspase-12激活途徑。GRP78、GRP94、ERP29等蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白,是發(fā)生ERS反應(yīng)的重要標(biāo)志性分子〔11〕。研究發(fā)現(xiàn),在腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后,大鼠發(fā)生心肌細(xì)胞凋亡的同時(shí)伴有 GRP78表達(dá)增多〔12〕;腹主動(dòng)脈結(jié)扎(TAC模型)引起心肌重構(gòu)過(guò)程中,GRP78、GRP94、CHOP/GADD153的表達(dá)均上調(diào)〔13〕;缺血再灌注損傷引起心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中,ERS的標(biāo)志性分子也大量表達(dá)〔14〕。這些研究都證實(shí) ERS參與心肌細(xì)胞凋亡和心肌重構(gòu)的發(fā)生與發(fā)展。本文研究表明,高脂血癥大鼠模型心肌組織排列紊亂,GRP78在基因及蛋白水平表達(dá)均上調(diào),心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加,提示高脂血癥激活了 ERS相關(guān)的細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和心肌組織結(jié)構(gòu)異常,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

辛伐他汀屬于羥甲基戊二酸單酰輔酶 A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,它不僅能夠調(diào)節(jié)血脂水平,還具有清除氧自由基、抑制細(xì)胞黏附分子表達(dá)和改善血管內(nèi)皮功能等作用。新近研究還發(fā)現(xiàn),在前腦缺血再灌注損傷模型中,辛伐他汀可以通過(guò)減弱 ERS發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用〔15〕。本文在高脂血癥大鼠模型中發(fā)現(xiàn),辛伐他汀不但可以顯著降低高脂血癥大鼠的血脂(包括 TC和TG)水平,而且顯著大鼠的心肌細(xì)胞凋亡并且下調(diào)心肌組織 ERS標(biāo)志性分子GRP78的表達(dá),提示辛伐他汀可能通過(guò)干預(yù) ERS途徑抑制高脂血癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡并改善其心肌組織結(jié)構(gòu)從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

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