吳 嵐 周素嫻 劉開(kāi)祥 俸軍林 李清華

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西 桂林 541001)

在糖尿病高血糖情況下,缺血性腦損傷加重可能與乳酸堆積、興奮性氨基酸、自由基、Ca2+超負(fù)荷及細(xì)胞凋亡等有密切關(guān)系。青藤堿(Sin)是從中藥青風(fēng)藤中提取的生物堿單體。它具有抗炎、免疫抑制、鎮(zhèn)痛、降壓、抗心律失常等藥理作用。前期研究證實(shí),青藤堿對(duì)正常血糖大鼠缺血再灌注腦損傷有保護(hù)作用〔1〕,但機(jī)制未明。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,研究Sin對(duì)其 Bcl-2和 caspase-3蛋白表達(dá)的影響,探討其保護(hù)作用的可能分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 糖尿病大鼠模型建立及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 健康 Wistar大鼠,雄性,清潔級(jí),共 50只,體質(zhì)量(250±30)g(廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。大鼠喂飼高脂飼料(1%膽固醇,10%豬油,0.2%丙硫氧嘧啶,89%基礎(chǔ)飼料〔2〕)。 4 w后,單次空腹腹腔注射 30mg/kg鏈脲佐菌素(購(gòu)于 Sigma公司),繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng),于注射后 1、2個(gè)月測(cè)定體重和血糖〔3〕。選擇非空腹血糖 16.7～25.6 mmol/L的大鼠作為造模成功的糖尿病大鼠。經(jīng)檢測(cè)模型成功大鼠共 45只,將其中 40只大鼠按隨機(jī)分組原則分為假手術(shù)組(10只)、缺血再灌注組(10只)、Sin低劑量治療組(10只)及 Sin高劑量治療組(10只)。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法 Sin低劑量治療組(30 mg/kg)和高劑量治療組(60mg/kg)均于術(shù)前30 min分別給予大鼠腹腔注射,假手術(shù)組和缺血再灌注組給予等量的生理鹽水腹腔注射。缺血再灌注組和 Sin低、高劑量治療組建立腦缺血 90 min再灌注 24 h動(dòng)物模型。

1.2.2 腦缺血再灌注損傷模型的建立 參照 Longa等〔4〕方法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分:各組分別在再灌注 24h進(jìn)行評(píng)分。0分:正常,無(wú)神經(jīng)學(xué)征象;1分:動(dòng)物不能完全伸展右前肢;2分:動(dòng)物右側(cè)肢體癱瘓,行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈,出現(xiàn)追尾現(xiàn)象;3分:動(dòng)物行走向右側(cè)跌倒,或動(dòng)物不能站立或動(dòng)物打滾;4分:無(wú)自發(fā)活動(dòng),有意識(shí)障礙。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分在 1～3分為模型成功。

1.2.3 Bcl-2和 caspase-3表達(dá)的免疫組化染色 再灌注24h,各組隨機(jī)取 5只大鼠,用生理鹽水和多聚甲醛進(jìn)行心臟灌流固定,斷頭取腦。在左側(cè)大腦半球距離嗅球尖端 7～11 mm之間冠狀切取約 5 mm厚腦組織塊,固定、脫水、包埋成臘塊,連續(xù)切片,厚 5μm。連取 5張,1張作 HE染色,觀察病理形態(tài)學(xué)改變。其余 4張作免疫組化染色。用SP法進(jìn)行Bcl-2和 caspase-3蛋白的免疫組化染色。一抗由北京中山生物技術(shù)有限公司提供。陰性對(duì)照片用 PBS液代替一抗。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃染色顆粒代表 Bcl-2和caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。于每個(gè)鼠腦取 1張切片,每張切片分別隨機(jī)選取左側(cè)大腦半球額頂部皮質(zhì) 5個(gè)不重復(fù)高倍鏡視野(×400),計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),算出平均數(shù)即為每張切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 TTC染色 再灌注 24 h,將各組另外 5只大鼠深麻后開(kāi)顱取腦。將鼠腦置于 -4℃冰箱 20 min后,將其切成 5等份冠狀位切片,置于 2%TTC溶液中,水浴、多聚甲醛液固定。用計(jì)算機(jī)病理圖像分析儀及梯形法計(jì)算出梗死灶體積,各腦片梗死灶體積之和即為梗死體積。左側(cè)大腦半球梗死灶區(qū)呈白色,主要為額頂部皮質(zhì)和尾殼核,正常組織呈紅色。部分組織表現(xiàn)為由白色向紅色過(guò)渡區(qū)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用 SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以 x±s表示,組間差異顯著性檢驗(yàn)采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組Bcl-2表達(dá)的比較 假手術(shù)組可見(jiàn) Bcl-2呈少量表達(dá)。缺血再灌注組 Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增多,部位主要分布于缺血周邊區(qū)的額頂皮質(zhì),與假手術(shù)組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)圖 1。與缺血再灌注組比較,Sin高、低劑量治療組的 Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞均明顯增加(P＜0.05),高、低劑量組之間差異亦具有顯著性(P＜0.05),見(jiàn)表 1。

圖1 Bcl-2和 caspase-3的免疫組化圖(SP,×400)

2.2 各組 caspase-3蛋白表達(dá)的比較 假手術(shù)組 caspase-3呈少量表達(dá)。缺血再灌注組caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增多,部位主要分布于缺血周邊區(qū)額頂皮質(zhì)和海馬組織,與假手術(shù)組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)圖 1。與缺血再灌注組比較,Sin高、低劑量治療組的caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少(P＜0.05),高、低劑量組之間差異亦具有顯著性(P＜0.05),見(jiàn)表 1。

表1 各組 Bcl-2、caspase-3表達(dá)和腦梗死體積的比較(x±s,n=5)

2.3 各組腦梗死體積的比較 大鼠腦缺血再灌注 24 h TTC染色:TTC染色后,缺血再灌注 24 h左側(cè)大腦半球梗死灶區(qū)呈白色,主要為額頂部皮質(zhì)和尾殼核,正常組織呈紅色。部分組織表現(xiàn)為由白色向紅色過(guò)渡區(qū)。Sin高、低劑量治療組梗死體積較缺血再灌注組減小(均 P＜0.05),高、低劑量組之間差異亦具有顯著性(P＜0.05),見(jiàn)圖 2。

圖2 缺血再灌注損傷腦梗死TTC染色

2.4 各組缺血側(cè)腦組織病理學(xué)改變的比較 假手術(shù)組腦組織切片可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及毛細(xì)血管形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整,錐體細(xì)胞核大而圓,核仁明顯。缺血再灌注組呈缺血改變,梗死區(qū)正常組織結(jié)構(gòu)消失,結(jié)構(gòu)不清,間質(zhì)水腫,有炎細(xì)胞浸潤(rùn);錐體細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞核固縮深染,胞漿嗜伊紅。部分細(xì)胞壞死,并可見(jiàn)呈篩狀壞死的壞死灶。Sin不同劑量治療組腦組織缺血改變較缺血再灌注組明顯減輕,壞死范圍縮小,細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整,細(xì)胞核固縮減少,細(xì)胞間質(zhì)水腫輕,高劑量組與低劑量組之間比較,缺血改變更輕。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn) Sin可治療正常血糖的腦缺血再灌注大鼠,顯示青藤堿對(duì)缺血再灌注腦損傷有保護(hù)作用〔1〕。但具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷給予不同劑量的 Sin治療,可明顯減少腦梗死體積,減輕缺血造成的病理?yè)p害,并且高劑量Sin的腦保護(hù)效果更顯著。

在腦缺血急性期,神經(jīng)元壞死與凋亡并存,細(xì)胞壞死位于缺血中心區(qū),細(xì)胞凋亡主要出現(xiàn)在缺血半暗帶。Bcl-2基因是一種癌基因,它所編碼的膜相關(guān)蛋白是一種強(qiáng)有力的細(xì)胞死亡抑制因子,它在調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡過(guò)程中發(fā)揮著抑制凋亡的關(guān)鍵作用。目前認(rèn)為 Bcl-2是與腦缺血神經(jīng)元凋亡關(guān)系最密切的內(nèi)源性凋亡抑制基因〔5〕。 Lawrence等〔6〕在過(guò)度表達(dá) Bcl-2基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn),Bcl-2蛋白能減輕大腦中動(dòng)脈阻塞引起的缺血性腦損傷,使腦梗死體積縮小。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Bcl-2蛋白在糖尿病大鼠假手術(shù)組腦組織中幾乎沒(méi)有表達(dá),但在缺血再灌注后,Bcl-2則出現(xiàn)了表達(dá),主要出現(xiàn)在缺血半暗帶的額頂皮質(zhì),我們推測(cè)這是機(jī)體對(duì)抗凋亡的一種反應(yīng)。而Sin治療組大鼠腦組織中 Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯高于缺血再灌注組,表明Sin可能通過(guò)上調(diào) Bcl-2蛋白的表達(dá)從而對(duì)缺血再灌注腦損傷起到一定的保護(hù)作用。

天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白激酶家族(caspases)是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最重要的蛋白酶,凋亡的最后實(shí)施是通過(guò) caspases的激活而實(shí)現(xiàn)的。caspases的激活表現(xiàn)為“瀑布式”的級(jí)聯(lián)反應(yīng),而 caspase-3是 caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)中下行的最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶,在各種程序啟動(dòng)的凋亡程序中起最后樞紐的作用〔7〕,它的激活可通過(guò)裂解 DNA依賴性蛋白激酶等,改變其結(jié)構(gòu),促使細(xì)胞凋亡〔8〕。有研究發(fā)現(xiàn)〔9,10〕在缺血性神經(jīng)損傷過(guò)程中,抑制caspase-3活性可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究表明,Sin通過(guò)降低 caspase-3的表達(dá)與活化,可減少再灌注期神經(jīng)元凋亡的發(fā)生,從而促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)元的存活。

本實(shí)驗(yàn)研究表明,Sin增加缺血再灌注后Bcl-2蛋白表達(dá)同時(shí)抑制 caspase-3蛋白表達(dá),對(duì)凋亡有抑制作用。近年有研究表明〔11〕,缺血半影區(qū) Bc1-2過(guò)度表達(dá)可以抑制 caspase-3的活性,關(guān)于 Sin是否通過(guò)對(duì) Bc1-2的激活抑制 caspase-3蛋白表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用機(jī)制我們還將做進(jìn)一步探討。

1 吳 嵐,劉開(kāi)祥,俸軍林,等.青藤堿對(duì)鼠腦缺血再灌注損傷環(huán)氧化酶-2表達(dá)及前列腺素 E2含量的影響〔J〕.中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2009;24(4):293-6.

2 李儀奎,王欽茂 .中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)〔M〕.上海:科學(xué)技術(shù)出版社,1991:398.

3 李愛(ài)卿,王志慧,趙躍斌 .高糖高脂飼料誘導(dǎo) 2型糖尿病大鼠模型〔J〕.臨床醫(yī)藥實(shí)踐雜志,2005;14(2):2-3.

4 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occusion without cranietomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

5 GrahamSH,ChenJ,Clark RS.Bcl-2 family gene products in cerebral ischemia and traumatic brain injury〔J〕.J Neurotrauma,2000;17:831-41.

6 Lawrence MS,Ho DY,Sun GH,et al.Over expression bcl-2 with Herpes simplex virus vectors protects CNSneurons against neurological insults in vitro and vivo〔J〕.JNeuroscience,1996;6(2):394-6.

7 Faubel S,Edelstein CL.Caspases as drug targetsin ischemic organ injury〔J〕.Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord,2005;5(3):269-87.

8 Wellington CL,Hayden MR.Caspases and neurodegeneration:on the cutting edge of new therapeutic approaches〔J〕.Clin Genet,2000;57(1):1-7.

9 Loetscher H,Niederhauser O,Kemp J,et al.Is caspase-3 inhibition avalid therapeutic strategy in cerebral ischemia〔J〕?Drug Discov Today,2001;6(13):671-80.

10 Li H,Colbourne F,Sun P,et al.Caspaseinhibitors reduceneuronal injury after focal but not global cerebra lischemia in rats〔J〕.Stroke,2000;31(1):176-82.

11 Zhao H,Yenari MA,Cheng D,et al.Bc1-2 overexpression protects against neuron loss within the ischemic margin following experimental stroke and inhibits cytochrome C translocation and caspase-3 activity〔J〕.Neurochem,2003;85:1026-36.