段旭東 趙 輝 王曉紅 于文濤 王曉媛 張雅蘭

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院中醫(yī)外科,河北 石家莊 050000)

支氣管哮喘氣管重塑是其主要臨床特征之一,是導致呼吸道高反應性及肺功能持續(xù)性、進行性損傷的主要原因,并可能導致頑固性哮喘〔1〕。氨茶堿作為治療支氣管哮喘的經典藥物臨床應用廣泛,其藥理研究多集中于抗炎、免疫調節(jié)的作用,對氣道重塑的影響尚未見報道。本實驗擬通過探討氨茶堿對支氣管哮喘大鼠支氣管組織中凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax含量的影響,進一步探討氨茶堿對支氣管哮喘氣管重塑的防治作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級 SD大鼠 24只,雌雄各半,體重 180～220g,由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供,動物合格證號:SCXK(鄂)2004-007。室溫 20℃飼養(yǎng),自由進食水。

1.2 藥物 氨茶堿,天津金耀氨基酸有限公司產品,批準文號:國藥準字 H12020978。批號:20050917,250mg,10 ml/支。

1.3 主要儀器及試劑 彩云 JWC-201D超聲霧化器:鞍山市同信醫(yī)用儀器廠產品。卵蛋白:美國 Sigma公司產品。氫氧化鋁:天津市化學試劑三廠生產,分析純。NDY-1000彩色病理圖像分析儀:武漢同濟醫(yī)科大學千屏影像科技公司生產。BH-2光學顯微鏡:Olympus公司生產。

1.4 動物分組及給藥 實驗大鼠按隨機表分為正常組、模型組、氨茶堿治療組(簡稱治療組),每組 8只。治療組從第 1次哮喘激發(fā)開始灌胃給藥,直至處死,2 ml每日 1次,用藥劑量按有關公式〔2〕,將人臨床用藥劑量折算為大鼠用藥劑量,模型組、正常組均以 2 ml生理鹽水代替氨茶堿,每日 1次灌胃。

1.5 模型建立 實驗組參照〔3〕,分別于第 1天及第 8天大鼠腹腔內注射新鮮配制的卵蛋白溶液 1 ml(內含卵蛋白 100 mg,氫氧化鋁 100 mg)致敏,第 15天起哮喘模型組、治療組開始霧化吸入 1%卵蛋白激發(fā)哮喘,霧化流量 5 ml/min,隔日 1次,每次 20 min,共 4 w,以大鼠出現(xiàn)呼吸加快,口唇發(fā)紺,腹肌痙攣,點頭呼吸及站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為激發(fā)成功。正常組以生理鹽水代替卵蛋白進行腹腔注射及霧化吸入。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 病理組織學觀察 10%水合氯醛 3.5 ml/kg腹腔內注射麻醉,麻醉完全后開胸,迅速結扎右主支氣管,取右肺中葉,4℃4%多聚甲醛固定,脫水、包埋、切片。HE染色,鏡下觀察病理學改變。采用 NDY 1000型圖像分析儀測量大鼠氣道壁面積、支氣管平滑肌的面積,用完整支氣管管腔的內周長(Pi)進行標準化。

1.6.2 支氣管上皮及其周圍組織中 Bcl-2、Bax含量測定 石蠟切片經二甲苯脫蠟及梯度酒精脫水,磷酸緩沖液(PBS)漂洗5 min×2次;3%的雙氧水甲醇溶液室溫孵育 5～10 min,以消除內源性過氧化物酶的活性,PBS洗滌 3次;將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0),微波爐加熱至沸騰后斷電,間隔 5～10 min,反復 1～2次,冷卻后 PBS洗滌 2次,滴加5%正常山羊血清封閉,室溫孵育 20 min。傾去多余液體,滴加Bcl-2和 BaxⅠ抗(1∶100稀釋)濕盒孵育,4℃冰箱內過夜,PBS洗滌5 min×2次;滴加生物素標記的二抗工作液,37℃孵育45 min,PBS洗滌 5 min×2次;滴加試劑過氧化物酶(SABC)(1∶100稀釋),37℃孵育 20 min,PBS洗滌 5 min×2次;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色 5～15 min,終止呈色反應;蘇木素襯染,常規(guī)裱片、干燥、脫水、透明、封片。光學顯微鏡下,Bcl-2和 Bax蛋白染色呈棕黃色顆粒。Bcl-2蛋白測定:每張切片高倍鏡下(×400)由同一觀察者選取支氣管上皮四周及左上共 5個視野,計算機圖像處理軟件半定量測定支氣管Bcl-2含量(以染色吸光度值表示)。Bax蛋白測定:每張切片高倍鏡下(×400)由同一觀察者選取支氣管壁四周及左上共 5個視野,計算機圖像處理軟件半定量測定支氣管 Bcl-2含量(以染色吸光度值表示)。

1.7 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用 x±s表示,用 Stata8.0統(tǒng)計軟件處理,統(tǒng)計方法采用單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1 支氣管面積、支氣管平滑肌面積的變化 與正常組相比,哮喘激發(fā) 4 w后模型組大鼠支氣管壁面積、平滑肌面積明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義(t=5.13,P=0.00,t=2.85,P=0.00)),治療組大鼠支氣管壁面積、平滑肌面積明顯低于模型組,差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.77,P=0.00,t=1.26,P=0.01)。 見表 1,圖 1。

2.2 Bcl-2、Bax蛋白含量的變化 與正常組相比,哮喘激發(fā)4 w后,模型組大鼠支氣管-肺組織中 Bcl-2、Bax蛋白含量明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義(t=52.4,P=0.00,t=61.0,P=0.00)。與模型組相比,治療組大鼠支氣管上皮中凋亡相關蛋白 Bcl-2含量明顯高于模型組,差異具有統(tǒng)計學意義(t=28,P=0.009),支氣管周圍組織中Bax含量高于模型組,差異具有統(tǒng)計學意義(t=36.5,P=0.01)。見表 2,圖 2。

表1 各組大鼠氣道形態(tài)學的比較 (x±s,n=8,%)

表2 氣道重塑大鼠肺組織中 Bcl-2、Bax含量的變化(x±s)

圖1 支氣管平滑肌病理圖片(HE,×400)

圖2 Bcl-2、Bax免疫表達(DAB,×400)

3 討 論

哮喘氣管重塑本質上是機體對氣管上皮慢性損害不完全修復的結果,Lee〔4〕等研究表明,上皮細胞損傷可誘發(fā)單核細胞浸潤、上皮下組織纖維化,成纖維細胞和肌細胞的增殖等一系列致纖維化的反應。此過程涉及嗜酸性粒細胞、支氣管上皮細胞、平滑肌細胞等多種因素參與,變態(tài)反應性炎癥所導致的微環(huán)境改變可以導致氣管多種細胞 DNA合成增加以及細胞增生,從而導致氣管重塑,減少支氣管上皮細胞損傷,減少支氣管內及周圍炎癥細胞及平滑肌細胞的數(shù)量可有效地抑制氣道重塑〔5〕。近年的研究表明細胞的凋亡受多種基因的調控,其中Bcl-2,Bax被認為是抑制及促進細胞凋亡最重要的調控基因。

本研究結果提示哮喘氣道重塑過程中由于氣道炎癥導致氣道上皮損傷,機體通過提高支氣管上皮中 Bcl-2含量從而抑制上皮細胞凋亡以對抗氣道重塑;治療組氣道上皮細胞具有更好的抗凋亡能力,氣道上皮的完整可防止由氣道上皮損傷引起的氣道重塑〔4〕。

Bax基因位于 19q13.3-13.4,由 6個外顯子組成,是重要的促凋亡基因,當Bax大量表達時,細胞對凋亡信號的反應增強,細胞凋亡增多,因此 Bax被稱為“死亡激動劑”。

本實驗提示正常情況下氣道壁-肺組織細胞凋亡數(shù)量少,提示機體在氣道重塑過程中通過加速氣道壁-肺組織細胞(包括氣道上皮基底膜細胞、平滑肌細胞及氣道周圍組織細胞)凋亡以抑制氣道重塑。與模型組相比,治療組支氣管壁面積、支氣管平滑肌面積均明顯降低而 Bax含量升高明顯,提示治療組較高的支氣管壁-肺組織細胞凋亡可抑制氣道重塑。

應用氨茶堿治療哮喘已有 80多年的歷史,口服或直腸給藥吸收迅速,有效血藥濃度為 10～20 mg/L,理論上給予0.5 mg/kg氨茶堿可使血清藥物濃度上升 1 mg/L,其治療劑量與中毒劑量十分接近,20mg/L血藥濃度即可出現(xiàn)中毒反應,血清藥物濃度大于 35 mg/l時可引起呼吸急促、驚厥甚至死亡〔6〕。本實驗中原設置的高劑量氨茶堿(70 mg/kg)組實驗動物,用藥后呼吸興奮、驚厥等中毒反應明顯,并有數(shù)只在實驗過程中死亡,無法進行統(tǒng)計處理。

綜上所述,氨茶堿具有較好的抑制支氣管哮喘氣道重塑的作用,其作用提高支氣管上皮及支氣管壁-肺組織中 Bcl-2、Bax含量,減少氣道上皮細胞的損傷,促進支氣管壁-肺組織細胞凋亡的作用相關。

1 彭淑梅,趙建平,王淑珍,等 .內皮素在兒童重度哮喘中的意義及作用〔J〕.廣東醫(yī)學,2002;23(2):175-6.

2 陳 奇.中藥藥理研究方法學〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,1993:33.

3 王文建,王 莉,楊西華,等 .川芎嗪對大鼠支氣管哮喘模型氣道重塑的影響及機制〔J〕.中華結核和呼吸雜志,2004;27(12):833-6.

4 Lee CG,Cho SJ,Kang MG,et al.Early growth response gene 1-mediated apoptosis is essential for transforming growth factor beta l induced pulmonary fibrosis〔J〕.J Exp Med,2004;200(3):377-89.

5 孔祥永,欒 斌,郭 杰,等 .實驗性哮喘氣道細胞DNA合成和氣道重塑研究〔J〕.中國兒童保健雜志,2003;11(1):39-41.

6 國家藥典委員會;臨床用藥須知.中華人民共和國藥典〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:244.