張林波 黃 帥 馬廣麗 吳紅珍 姚 華 章 宏

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130118)

近幾十年來隨著老年醫(yī)學(xué)的發(fā)展,有關(guān)氧化應(yīng)激與衰老的研究日益增多,目前對氧化應(yīng)激在衰老發(fā)生發(fā)展中的作用已經(jīng)有了一定程度的了解。本文在國內(nèi)外相關(guān)研究的基礎(chǔ)上,通過D-半乳糖腹腔注射建立衰老動物模型,通過生化、免疫手段系統(tǒng)觀察氧化應(yīng)激與衰老發(fā)病機制間的關(guān)系,旨在為衰老機制及抗氧化藥物開發(fā)奠定一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 20只 5～8周齡雄性昆明鼠,體重18～25 g(購自吉林大學(xué)實驗動物學(xué)部),自由攝食、飲水飼養(yǎng) 1 w,室溫 22℃～25℃。隨機分為正常組和模型組,每組 10只。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 D-半乳糖(Sigma公司,臨用前用0.9%生理鹽水配成濃度為3mg/ml的溶液,0.22μm濾膜過濾除菌),四甲基偶氮唑鹽(MTT)、ConA(北京鼎國公司),超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)生化檢測試劑盒及考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)定量試劑盒(南京建成生物工程研究所),722型分光光度計(北京普析通用儀器有限公司),CO2培養(yǎng)箱(INCUBATOR),酶聯(lián)免疫檢測儀(美國 Bio-Rad公司)。

1.2.2 衰老模型的建立 參照文獻(xiàn)〔1,2〕,采用腹腔注射 D-半乳糖的方法建立衰老模型。模型組按每天 150 mg/kg劑量,腹腔連續(xù)注射 42d,造成衰老模型。對照組按同等劑量腹腔注射生理鹽水。實驗期間,各組小鼠自由飲水和進(jìn)食。

1.2.3 衰老模型的鑒定

1.2.3.1 外觀特征鑒定 觀察小鼠精神、活動狀況、皮毛光澤及皮膚彈性、飲食飲水量、大小便。

1.2.3.2 運動能力鑒定 運動能力的強弱一般通過抗靜態(tài)疲勞測試和負(fù)重力竭性游泳測試兩個方面來表現(xiàn)。建模后,與正常組相比,凡小鼠在抗靜態(tài)疲勞測試和負(fù)重力竭性游泳測試中所用時間明顯增多者即為成功模型?？轨o態(tài)疲勞測試(靜力性運動能力):取長 2 m、直徑 0.5 cm的懸垂導(dǎo)線,將待測小鼠置于距導(dǎo)線末端 12cm處,記錄小鼠 3次從抓線至掉落時間。負(fù)重力竭性游泳測試(運動性運動能力):小鼠尾負(fù)重 100 g/kg,放入 50cm×40cm×30 cm水箱中游泳,水溫 28℃±2℃,小鼠連續(xù) 3次沉入水中,每次超過 10 s不能浮出水面為力竭,記錄小鼠游泳至力竭時間。

1.2.3.3 免疫功能鑒定 通過對免疫器官指數(shù)和脾淋巴細(xì)胞增殖活性的測定來衡量機體的免疫功能。建模后,與正常組相比,凡小鼠的免疫器官指數(shù)(胸腺和脾臟指數(shù))和脾淋巴細(xì)胞增殖活性明顯降低者即為成功模型。免疫器官指數(shù)(胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù))的測定:實驗結(jié)束后,將小鼠稱重,各組小鼠經(jīng)摘眼球取血后,脫頸椎處死,75%酒精浸泡消毒,無菌開腹取脾臟、胸腺,用電子稱稱重,以臟器濕重(mg)/體重(g)表示小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。即脾臟指數(shù) =脾臟重量(mg)/小鼠體重(g);胸腺指數(shù) =胸腺重量(mg)/小鼠體重(g)。脾淋巴細(xì)胞增殖活性的測定采用 MTT法。

1.2.3.4 血清、腦組織中SOD、MDA的檢測 總 SOD(T-SOD)活力的測定采用黃嘌呤氧化酶法,MDA的測定采用硫代巴比妥酸法。腦組織中 SOD、MDA的檢測需先制備 10%腦組織勻漿后再進(jìn)行測定。具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,實驗結(jié)果以 x±s表示,組間差值采用 t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠外觀特征的比較 模型組小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡,瞇眼、扎堆,反應(yīng)遲鈍、行動遲緩,毛色枯槁無光澤、散亂豎起,皮膚彈性差,飲食飲水量減少,大便較稀、有腥臭,逐漸消瘦。正常組小鼠精神好,行動敏捷;毛發(fā)光澤、順滑,皮膚彈性好,大便成形,呈黃褐色,無腥臭。

2.2 小鼠運動能力的比較

2.2.1 小鼠抗靜態(tài)疲勞測試的比較 正常組小鼠抓繩時間〔(3.39±0.36)min〕較模型組小鼠抓繩時間〔(1.10±0.21)min〕顯著延長(P＜0.01)。

2.2.2 小鼠負(fù)重力竭性游泳測試的比較 模型組小鼠游泳至力竭時間〔(25.75±1.37)min〕顯著縮短于對照組〔(50.21±2.56)min〕(P＜0.01)。

2.3 小鼠免疫器官指數(shù)(脾臟、胸腺指數(shù))的比較 見表 1。與正常組比較,模型組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低(P＜0.01)。

表1 小鼠免疫器官指數(shù)比較(mg/g,x±s)

2.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的比較 無菌分離正常鼠脾臟淋巴細(xì)胞,用不同濃度的 ConA測定脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),ConA 100μg/μl刺激指數(shù)為 1.64±0.07,ConA 50 μg/μl為2.23±0.11,ConA 5 μg/μl為 1.28 ±0.09。 可 見 ConA 50μg/μl刺激指數(shù)最高,故本實驗采取 50μg/μl的 ConA進(jìn)行刺激。與正常組比較,模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性(1.41±0.14)顯著低于對照組(2.22±0.11)(P＜0.01)。

2.5 小鼠血清、腦組織中 SOD活性的比較 見表 2。與正常組比較,模型組小鼠血清、腦組織中SOD活性均顯著降低(P＜0.01)。

表2 小鼠血清、腦組織中SOD活性(x±s)

2.6 小鼠血清、腦組織中MDA含量的比較 見表 3。與正常組比較,模型組小鼠血清、腦組織中MDA含量均顯著升高(P＜0.01)。

表3 小鼠血清、腦組織中MDA含量(x±s)

3 討 論

3.1 D-半乳糖致衰老動物模型的建立與評價 目前衰老的動物模型大致分為 4類:(1)中醫(yī)衰老理論指導(dǎo)下制備的動物模型,包括腎虛、脾虛、陰虛、陽虛、氣虛、血虛、血淤衰老模型等〔3,4〕;(2)根據(jù)現(xiàn)代衰老學(xué)說制備的衰老模型,包括根據(jù)衰老的自由基學(xué)說制備的 O3損傷衰老模型〔5〕,根據(jù)衰老的代謝學(xué)說制備的 D-半乳糖致衰老動物模型,根據(jù)衰老的免疫學(xué)說制備的去胸腺衰老模型〔6〕;(3)直接采用老齡動物作為自然衰老模型;(4)快速老化模型小鼠。其中 D-半乳糖致亞急性衰老模型與自然衰老狀態(tài)最為相似,且造模周期短、衰老變化明顯、模型穩(wěn)定、重復(fù)性好,是國際上較為公認(rèn)的衰老模型,應(yīng)用最為廣泛。D-半乳糖致衰老模型是由我國學(xué)者龔國清等〔7〕首先提出。研究發(fā)現(xiàn)該模型在一定時間內(nèi)通過連續(xù)腹腔注射D-半乳糖,使機體細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度升高,在醛糖還原酶催化下還原成半乳糖醇。半乳糖醇為代謝終產(chǎn)物,這種物質(zhì)不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在組織細(xì)胞內(nèi),影響正常滲透壓,導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙和代謝紊亂,造成細(xì)胞損傷,最終導(dǎo)致機體衰老〔8,9〕。研究表明 D-半乳糖在其氧化酶的作用下,氧參與反應(yīng),可在體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基;而糖代謝的紊亂也影響到細(xì)胞抗氧化酶的合成,從而使細(xì)胞清除自由基的能力下降,這些都導(dǎo)致自由基的堆積,從而誘發(fā)氧化應(yīng)激,引起脂質(zhì)過氧化作用的鏈?zhǔn)椒磻?yīng),導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷。同時過氧化脂質(zhì)的分解終產(chǎn)物如 MDA可與DNA或RNA及蛋白質(zhì)和磷脂的有關(guān)物質(zhì)結(jié)合,使細(xì)胞膜成分改變、功能障礙,從而使得動物多種組織、器官形態(tài)以及生理、生化指標(biāo)出現(xiàn)明顯退行性變化,促進(jìn)衰老〔10〕。

3.2 氧化應(yīng)激、SOD、MDA與衰老 氧化應(yīng)激是活體內(nèi)細(xì)胞或組織活性氧族及其結(jié)構(gòu)和功能改變的不斷累積〔11〕,打破了體內(nèi)氧化與抗氧化體系之間的平衡關(guān)系,使自由基產(chǎn)生過多或清除能力下降,自由基的產(chǎn)生與清除失去平衡,引起衰老和多種疾病。SOD是一種重要的抗氧化酶類,長期以來被作為衰老與抗衰老研究的經(jīng)典指標(biāo)。衰老期間的確存在著 SOD變化,這種變化不僅包括活性或含量上減少,而且包括性質(zhì)上發(fā)生的變化;不僅包含整體上的變化,而且也包括離體組織和細(xì)胞水平上的變化,因此SOD活性的高低反映了機體清除自由基的能力。MDA是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物之一,可與蛋白質(zhì)、核酸及某些磷脂交聯(lián)形成 Schiff堿,可使細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈退行性改變,加速細(xì)胞老化過程。MDA含量高低反映了氧自由基水平和過氧化反應(yīng)的強度和速率,可以間接反映細(xì)胞受損程度,是公認(rèn)的可靠衰老指標(biāo)。SOD活性的降低可反映出機體氧化與抗氧化之間的平衡被破壞,并且清除自由基的能力也下降;MDA含量的升高可反映機體氧自由基的水平過高和氧化反應(yīng)的速率過快,并且機體受損害的程度加大。這些都說明SOD、MDA與衰老的發(fā)生有一定的關(guān)系,這兩個指標(biāo)的變化也證實了機體內(nèi)發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)一步說明氧化應(yīng)激參與了衰老的發(fā)生。

1 馬 虹,徐 鐮,田蘇平,等 .不同水溫游泳對小鼠行為、記憶和脂質(zhì)過氧化影響差異的研究〔J〕.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志,1999;15(3):222-5.

2 蔡曦光,許愛霞,葛斌等 .菟絲子多糖抑制衰老小鼠模型中氧自由基域的作用〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2005;27(13):1326-8.

3 董六一,范 麗,李桂芳,等 .銀杏總內(nèi)酯對衰老模型小鼠的作用〔J〕.藥學(xué)學(xué)報,2004;39(3):176-9.

4 冀敦福,季海剛.關(guān)于衰老與老年病中醫(yī)機制的探討〔J〕.天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2004;23(4):169-73.

5 周文泉,劉建華.中西醫(yī)結(jié)合延緩衰老的研究近況及展望〔J〕.中國中醫(yī)藥信息雜志,1997;4(8):8-10.

6 杜懷棠,周麗珍.近 10年中醫(yī)衰老學(xué)說研究述評〔J〕.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,1995;18(2):2-7.

7 陳友琴,胡新珉,劉鴻蓮,等 .YN-PTOL對 O3衰老模型自由基損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志,2000;17(1):57-8.

8 崔英俊,李慶章.滑菇多糖對衰老模型鼠不同時期免疫功能的影響〔J〕.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)報,2004;35(2):129-34.

9 龔國清.小鼠衰老模型的研究〔J〕.中國藥科大學(xué)學(xué)報,1991;22(2):101-3.

10 Song X,Bao M,Li D,et al.Advanced glycation in D-galactose induced mouse aging model〔J〕.Mech Aging Dev,1999;108(3):239-51.

11 陳 勤.抗衰老研究實驗方法學(xué)〔M〕.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1996:46.