陳良建，黃冬梅，張思慧，袁劍鳴

(中南大學(xué) 湘雅三醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙，410013)

贗復(fù)體修復(fù)上頜骨缺損一般是在術(shù)后 3～6月進(jìn)行，這段時(shí)期對(duì)缺損區(qū)未做修復(fù)治療，嚴(yán)重影響了患者的面容、言語(yǔ)、吞咽等功能，生活質(zhì)量下降，不利于患者的早期康復(fù)和身心健康[1-2]；因而，解決上頜骨切除術(shù)后早期修復(fù)很有必要。醫(yī)用硅橡膠是常用的假體植入材料，生物相容性好，質(zhì)地柔軟且富有彈性，能利用缺損區(qū)的組織倒凹獲得固位，是上頜骨切除術(shù)后早期修復(fù)材料的首選。但硅橡膠存在如下不足：表面親水性差，與機(jī)體的親合力差，材料表面拋光打磨困難，易發(fā)生細(xì)菌和真菌附著[3-4]，作為早期修復(fù)材料，可能增加口腔感染的機(jī)會(huì)，對(duì)傷口愈合不利。有學(xué)者采用添加抗菌藥物、短時(shí)間藥物浸泡等方法[3,5]對(duì)硅橡膠進(jìn)行表面處理，提高硅橡膠的抗菌性，但上述處理只是短時(shí)間內(nèi)有效，且易產(chǎn)生耐藥性，臨床應(yīng)用受限。載銀納米TiO2抗菌效果好、安全性高，是一種具有長(zhǎng)效性的無(wú)機(jī)抗菌劑[5]，在醫(yī)用硅橡膠中添加載銀納米TiO2有望成為改善其抗菌性能的一種方法。本文作者在醫(yī)用硅橡膠中添加不同量的載銀納米TiO2，探討添加載銀納米 TiO2對(duì)硅橡膠的抗菌性能及生物相容性的影響，以便為研制上頜骨缺損早期贗復(fù)體修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為：粒徑為20～80 nm的載銀納米TiO2，其形貌如圖1所示；醫(yī)用高溫硫化硅橡膠(江陰市國(guó)光硅橡膠制品有限公司生產(chǎn))；金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院檢驗(yàn)科提供)；小鼠成纖維細(xì)胞L929(中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室提供)。

圖1 載銀納米TiO2 TEM形貌Fig.1 TEM image of Ag-embedded nano-TiO2

1.2 試樣制備

常溫下將載銀納米 TiO2按質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和 2.5%分別加入醫(yī)用高溫硫化硅橡膠混合物中，制成厚約1.5 mm的樣品，放入真空干燥箱中高溫硫化(溫度約140 ℃，1.0～1.5 h)制備成長(zhǎng)×寬×高為10 mm×10 mm×1.5 mm的硅橡膠試樣，超聲清洗，分組密封裝袋，滅菌后備用。

1.3 性能檢測(cè)

1.3.1 添加載銀納米 TiO2硅橡膠抗菌性能(浸漬培養(yǎng)法)

用接種環(huán)從培養(yǎng)基中取少量金黃色葡萄球菌，加入無(wú)菌生理鹽水中，制成含菌濃度為1×105CFU/mL的菌液。采用浸漬培養(yǎng)法測(cè)定添加載銀納米TiO2后硅橡膠的抗菌性能，將樣品浸泡在5 mL菌液中，空白對(duì)照組采用不加任何樣品的菌液；陽(yáng)性對(duì)照組菌液中含載銀納米TiO2粉末。在(37±1) ℃培養(yǎng)5～8 h后，各組取20 μL菌液接種于血瓊脂培養(yǎng)基上，在(37±1) ℃培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以上試驗(yàn)設(shè)置3組平行組，結(jié)果取平均值。將測(cè)定的菌落數(shù)按下式計(jì)算抗細(xì)菌率：

式中：r為抗細(xì)菌率，%；b為空白對(duì)照平均菌落數(shù)；c為添加抗菌劑的樣品平均菌落數(shù)。

1.3.2 添加載銀納米TiO2硅橡膠細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用含0%和2% TiO2的樣品進(jìn)行細(xì)胞毒性(MTT法)實(shí)驗(yàn)。

將TiO2含量為0%與2.0%的樣品按表面積與浸提介質(zhì)體積比(S/V)為1 cm2/mL浸泡于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中浸提72 h，收集浸提液并于4 ℃保存。

將L929細(xì)胞按5 000個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)1 d。分別設(shè)材料組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，材料組采用100%，50%和10%濃度的材料浸提液；陰性對(duì)照組為含 10%小牛血清的新鮮RPMI1640培養(yǎng)基；陽(yáng)性對(duì)照組為0.064%苯酚溶液。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。棄原培養(yǎng)液，分別加入200 μL上述實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液，在37 ℃，5% CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)3 d。采用MTT法用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)為490 nm 處測(cè)量各孔的光密度 OD490，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.3 添加載銀納米 TiO2硅橡膠對(duì)成纖維細(xì)胞黏附功能的影響

調(diào)整細(xì)胞濃度為 1.5×104個(gè)/mL，用加樣器取 2 mL細(xì)胞懸液分別接種于含0%與2.0% TiO2的樣品的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每樣本設(shè)5復(fù)孔，然后于5% CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48 h，最后，用2.5%戊二醛固定，將硅橡膠樣品置于環(huán)境掃描電子顯微鏡下檢測(cè)成纖維細(xì)胞在含0%和2.0% TiO2的樣品表面的黏附形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 添加不同濃度載銀納米TiO2硅橡膠的抗菌性

表1所示為添加不同濃度載銀納米TiO2硅橡膠抗菌率。從表1可看出：添加銀納米TiO2的濃度不同，其抗菌率也不同，在硅橡膠添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2.0%或2.5% TiO2時(shí)，試樣對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌率為100%。圖2所示為不同濃度載銀納米TiO2硅橡膠試樣與菌液復(fù)合培養(yǎng)8 h后，取 20 μL菌液接種于血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h的菌落生長(zhǎng)狀況。可見：含TiO22.0%和2.5%的試樣均未見細(xì)菌生長(zhǎng)。上述結(jié)果表明：當(dāng)硅橡膠添加載銀納米TiO2含量為0～2.0%時(shí)，其抗菌率隨添加量增加而增加；當(dāng) TiO2添加量為 2.0%及以上時(shí)，其抗菌率達(dá)100%。

表1 添加載銀納米TiO2硅橡膠的抗菌率Table 1 Antibacterial ratio of addition of Ag-embedded nano-TiO2 silicone rubber

2.2 MTT結(jié)果

培養(yǎng)3 d后L929細(xì)胞形貌如圖3所示。可見：在濃度為100%，50%和10%的材料浸提液作用下，L929形態(tài)與陰性對(duì)照組相比無(wú)明顯差別，而陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞體積變小，最后無(wú)完整細(xì)胞，只能看到細(xì)胞裂解后的碎片。

根據(jù)MTT法測(cè)定的光密度OD計(jì)算相對(duì)增殖率(R)：

其中：ODt和ODc分別為實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組光密度。

根據(jù)相對(duì)增殖率進(jìn)行細(xì)胞毒性分級(jí)(CTS)。添加載銀納米TiO2硅橡膠細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果如表2所示?？梢姡汉?.0% TiO2的樣品浸提液與陽(yáng)性對(duì)照組比較均差異顯著(P＜0.05)；不同濃度的浸提液間無(wú)顯著性差異，CTS均為0和1級(jí)，說(shuō)明本研究添加載銀納米TiO2硅橡膠對(duì) L929無(wú)毒性，符合《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 16886.5—2003》中對(duì)材料細(xì)胞毒性要求。

表2 添加載銀納米TiO2硅橡膠細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of cytotoxicity assay of Ag-embedded nano-TiO2 silicone rubber

圖2 菌液與樣品培養(yǎng)8 h后再接種于血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d的菌落生長(zhǎng)情況Fig.2 Colony growth situations of bacteria liquid cultured with samples for 8 h and then implanted blood agar cultured for 4 d

圖3 L929與添加載銀納米TiO2硅橡膠浸提液培養(yǎng)3 d后細(xì)胞形貌Fig.3 Situations of L929 cells cultured with leaching liquor of addition of Ag-embedded nano-TiO2 silicone rubber for 3 d

圖4 硅橡膠與L929細(xì)胞培養(yǎng)48 h后表面形貌Fig.4 SEM images of L929 cells after cultured 48 h with silicon rubber

2.3 添加載銀納米TiO2硅橡膠對(duì)L929黏附的影響

不含 TiO2和含 2.0% TiO2的硅橡膠樣品與 L929接觸培養(yǎng)48 h后，采用掃描電子顯微鏡檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示?？梢姡翰缓琓iO2的樣品表面細(xì)胞伸展欠佳，部分細(xì)胞蜷縮變形成棗核狀(圖4(a))；在含2.0% TiO2的硅橡膠樣品表面細(xì)胞黏附于材料表面，大部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，伸展良好，可見偽足，排列交織成網(wǎng)狀(圖4(b))。

3 討論

硅橡膠材料生物相容性好，是常用的假體植入材料，是上頜骨切除術(shù)后早期修復(fù)的首選材料，但硅橡膠表面細(xì)菌和真菌易附著，口腔感染機(jī)會(huì)增加，不利于傷口的愈合。有學(xué)者提出在硅橡膠中添加抗真菌藥及表面處理來(lái)改善硅橡膠的抗菌性能，如：Mark等[5]將克霉唑和置霉菌素加入硅橡膠中，發(fā)現(xiàn)有抗菌效果；Osterhof等[6]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：采用硅橡膠表面涂覆季銨硅烷涂層的方法能提高材料表面的抑菌性能，但作用效果短暫，不宜臨床推廣應(yīng)用。納米無(wú)機(jī)抗菌劑是利用納米技術(shù)將無(wú)機(jī)抗菌劑制備成納米微?？咕鷦哂袠O大的比表面積，提高了與細(xì)菌的親和力[7-10]，具有高安全性、長(zhǎng)效性、無(wú)耐藥性、廣譜性等優(yōu)點(diǎn)。本研究所采用的載銀納米 TiO2綜合了銀離子與納米 TiO2抗菌性能的優(yōu)點(diǎn)：實(shí)現(xiàn)銀的緩釋，延長(zhǎng)殺菌功效，安全、持久、無(wú)耐藥性，能與高分子材料進(jìn)行均勻混合。其抗菌機(jī)制可能是：銀沉積到納米TiO2表面，一方面，有效防止TiO2光催化時(shí)電子－空穴對(duì)的復(fù)合，從而促進(jìn)了TiO2的光催化活性[11]；另一方面，銀離子既可與菌體中酶蛋白中的巰基結(jié)合，代謝關(guān)鍵酶失活，致使細(xì)菌不能代謝而死亡[12]，銀離子也可與致病菌 DNA堿基結(jié)合并形成交叉鏈接，置換嘌呤和嘧啶中相鄰氮之間的氫鍵，使 DNA變性而不能復(fù)制，導(dǎo)致致病菌失活[13]。

本研究采用浸漬培養(yǎng)法檢測(cè)添加載銀納米 TiO2硅橡膠的抗菌性能，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：隨著載銀納米 TiO2加入量的增加，抗菌率也增加，當(dāng)TiO2加入量為2.0%和2.5%時(shí)，抗菌率可達(dá)100%?？赏茢嗫咕逝c添加載銀納米TiO2量有關(guān)，特別是與硅橡膠表面暴露的載銀納米 TiO2的量有關(guān)；當(dāng) TiO2添加量較低時(shí)，硅橡膠表面暴露的載銀納米TiO2的含量有限，故抗菌率較低；隨著添加量的增加，硅橡膠表面暴露的載銀納米TiO2的含量隨之增加，抗菌率也增高；當(dāng)添加載銀納米 TiO2的含量為 2.0%時(shí)，硅橡膠材料已有很好的抗菌效果。結(jié)果說(shuō)明：添加載銀納米TiO2抗菌劑的硅橡膠對(duì)L929無(wú)毒性，在硅橡膠中添加載銀納米TiO2的含量為2.0%比較合適。

影響細(xì)胞黏附的因素主要有表面形貌和粗糙度、表面化學(xué)、表面親水性、表面能和表面電荷等，一般認(rèn)為：粗糙的表面結(jié)構(gòu)、良好的表面化學(xué)組成、表面親水性、合適的表面自由能和表面電荷有利于細(xì)胞的黏附[14]。本研究在硅橡膠中添加載銀納米TiO2，體外細(xì)胞共培養(yǎng)，掃描電鏡檢測(cè)結(jié)果表明：添加載銀納米TiO2的硅橡膠有利于細(xì)胞的黏附。這可能與添加載銀納米 TiO2的硅橡膠表面暴露的納米粒子特有的表面界面效應(yīng)有關(guān)，納米粒子的表面原子數(shù)量大于普通粒子表面原子的原子數(shù)量，由于缺少鄰近的配位原子而具備很高表面能，材料表面有許多不飽和化學(xué)鍵，提供了很多吸附位點(diǎn)與作用位點(diǎn)，極易與外來(lái)原子通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)合，提高了與細(xì)胞的親和力，有利于細(xì)胞的黏附[15]。添加載銀納米TiO2的硅橡膠有望成為上頜骨切除術(shù)后早期修復(fù)的材料。

4 結(jié)論

(1) 添加載銀納米 TiO2的醫(yī)用硅橡膠具有抗菌性，當(dāng)添加載銀納米TiO2含量為 0～2.0%時(shí)，其抗菌率隨添加含量增加而增加，當(dāng)添加量為 2.0%及以上時(shí)，其抗菌率達(dá)100%。

(2) 添加載銀納米TiO2硅橡膠的浸提液無(wú)細(xì)胞毒性，符合生物材料細(xì)胞毒性要求。

(3) 在添加載銀納米TiO2硅橡膠的樣品表面黏附的細(xì)胞伸展良好，排列交織成網(wǎng)狀，而未添加載銀納米TiO2硅橡膠的樣品表面黏附的細(xì)胞伸展欠佳，偽足少，部分細(xì)胞蜷縮變形成棗核狀。添加載銀納米TiO2的硅橡膠有利于細(xì)胞的黏附。

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