胡國元，游慧珍，董蘭蘭，戴欣鵬，李偉偉，胡 婧，李友國

(1.武漢工程大學化工與制藥學院，綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北省新型反應器與綠色工藝重點實驗室，湖北 武漢 430074；2.華中農業(yè)大學農業(yè)微生物學國家重點實驗室,湖北 武漢 430070)

0 引 言

茯苓(Poriacocos)屬食藥兩用的大宗藥材.茯苓的主要成分是β-茯苓聚糖，約占干重92％.其次為戊聚糖、果糖、葡萄糖、甲殼素、腺嘌呤、組氨酸、蛋白質、粗纖維、膽堿、酶、卵磷脂、硬朊、麥角甾醇和灰分.另外，還含有三萜類化合物[1].從茯苓中提取制備的茯苓多糖或茯苓異多糖具有促進細胞分裂、補體激活、抗誘變、抗腫瘤 、增強免疫 等生物活性[2].茯苓加工利用或提取制備茯苓多糖的主要原料來源為茯苓菌核.但傳統(tǒng)的茯苓栽培法生產的茯苓菌核的生產周期長，產量也不高,且松材消耗量大.用液體培養(yǎng)技術生產茯苓菌絲體，從茯苓菌絲體和發(fā)酵液中提取茯苓多糖等活性物質，可較好地解決人工種植茯苓的替代問題，節(jié)省了大量的木材,對我國資源和生物多樣性的保護有著重要的意義.液體培養(yǎng)生產茯苓菌絲體可連續(xù)性地進行規(guī)?；I(yè)生產，大大縮短了生產時間，降低了生產成本[2-4].

文獻[3-5]報道碳源、氮源與初始pH值為影響茯苓菌絲體液體培養(yǎng)菌絲體產量和和發(fā)酵液中胞外多糖產量的主要因素.本實驗對不同茯苓菌株的菌絲生長速度比較，篩選出生長速度較快的菌株，在此菌株的基礎上探討了接種量、接種方式、碳源、氮源、初始pH值等因素對茯苓的菌絲體產量和胞外多糖產量的影響，以期確定茯苓液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中最適碳源、氮源和初始pH值.為規(guī)?；后w培養(yǎng)茯苓菌絲體和生產茯苓多糖作前期研究工作.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 鄂苓1號：從華中農業(yè)大學菌種實驗中心購買.鄂苓2號：由湖北省中醫(yī)研究院王克勤研究員惠贈.鄂苓1號和鄂苓2號均為湖北省茯苓栽培菌株.

1.1.2 培養(yǎng)基 母種斜面培養(yǎng)基[5]：葡萄糖20 g，酵母菌膏2 g，蛋白胨2 g， KH2PO40.46 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂20 g，水1 L，pH值為自然狀態(tài).

平板培養(yǎng)基：同母種斜面培養(yǎng)基.

種子培養(yǎng)基[3,6]：葡萄糖20 g，酵母菌膏5 g，蛋白胨4 g，KH2PO40.46 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1 L.

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：在不含碳源、氮源的種子培養(yǎng)基中，按L9(33)正交試驗表(表1)加入相應碳源和氮源，并調節(jié)pH值.

1.2 方法

1.2.1 接種和培養(yǎng) 由斜面菌種挑起1塊約1.0 cm2菌塊接入培養(yǎng)皿中央，26 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，菌絲均勻長滿培養(yǎng)皿，作為固體菌種備用[3,6].

在250 mL三角瓶裝入60 mL液體種子培養(yǎng)基，用打孔器把生長于平板外側的菌絲打孔接種到三角瓶，每瓶接種4塊直徑為8 mm的菌塊，培養(yǎng)溫度為26 ℃，搖瓶轉速為150 r/min的培養(yǎng)條件下進行搖瓶培養(yǎng)7 d，作為液體菌種備用[3,6].

菌種設置為固體種(接種4塊直徑為8 mm的菌塊[6])、液體種(按6％菌種量接液體種[3])；搖瓶體積及裝液量設置為250 mL三角瓶裝液60 mL[3]；搖床轉速150 r/min[3]，溫度26 ℃[3]；接固體種培養(yǎng)15 d[6]，接液體種培養(yǎng)6 d[3].

1.2.2 正交試驗 本試驗選擇L9(33)正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基中的[3-4]，正交試驗因素水平如表1.

表1 正交試驗L9(33)因素與水平

1.2.3 分析和測定a.生長速度的測定.用打孔器打孔接種1塊直徑為8 mm活化的茯苓菌塊在直徑為95 mm的平板中央， 26 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h測定菌塊菌絲生長的直徑，菌絲長滿平板停止測量.根據(jù)直徑的大小比較不同菌株菌絲的生長速度.b.菌絲干重的測定. 收取的發(fā)酵液以砂芯漏斗真空抽濾，用蒸餾水反復洗滌菌絲球，直到洗凈菌絲球中殘留的培養(yǎng)液，得到的菌絲球于60 ℃下烘干至恒重，以1 L發(fā)酵液中菌絲體干重(g/L)計.c.多糖的測定.采用苯酚—硫酸法測定發(fā)酵液中總糖的含量，用葡萄糖制作標準曲線，以校正系數(shù)0.9校正總糖含量的測定值，校正后的值為相應發(fā)酵液中的多糖含量[7].d.pH值測定.采用pHS-3C酸度計測定pH值.

1.2.4 光學顯微鏡觀察 將液體培養(yǎng)形成的不同直徑大小的菌絲球分別取樣，制片，觀察，拍照[8].

2 結果與討論

2.1 不同茯苓菌株菌絲生長速度的測定

將活化的鄂苓1號、2號同時采用打孔器接種到平板上培養(yǎng)4 d，其菌絲生長速度測定結果見圖1.鄂苓1號、2號在平板上菌絲濃厚粗壯，長勢旺盛.從圖1可知，鄂苓2號比1號生長速率相對快些，后續(xù)實驗選擇鄂苓2號為試驗菌株.

圖1 2個茯苓菌株菌絲生長速度測定

2.2 不同固體種接種量對茯苓菌絲體產量的影響

在250 mL三角瓶中裝入60 mL種子培養(yǎng)基，將活化的鄂苓2號菌種用打孔接種的方式接種，接種量設置為4、6、8和10塊.通過液體搖瓶培養(yǎng)，比較其生成的菌絲體重量來確定最佳接種量.結果表明(見表2)，接種量為4塊時，菌絲體產量最高.

表2 不同固體種接種量對茯苓菌絲體產量的影響*

2.3 不同接種方式對茯苓菌絲體產量的影響

在鄂苓2號的液體培養(yǎng)中，采用固體種、液體種接種，培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，進行對比試驗的結果見表3.在茯苓菌絲培養(yǎng)過程中，接液體種比固體種產量高，菌絲發(fā)育點多、接種后菌絲蔓延迅速、菌齡整齊，培養(yǎng)的菌絲球大小較均勻.

表3 不同接種方式對茯苓菌絲體產量的影響*

2.4 茯苓液體培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗

本試驗選擇L9(33)正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基[3-4]，正交試驗因素水平見表1.分別做固體接種方式、液體接種方式的正交試驗，分別以菌絲體干重、胞外多糖含量為考察指標，分析試驗結果，確定茯苓培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的最適碳源、氮源和初始pH值.

2.4.1 以菌絲體干重為指標，固體接種方式的正交試驗 采用固體接種茯苓菌絲塊4塊于搖瓶中培養(yǎng)15 d，以菌絲體干重為指標，正交試驗結果及分析如表4.

表4 固體接種的正交試驗結果與分析

由表4可知，RA>RB>RC.說明3因素對固體接種培養(yǎng)菌絲體生物量的影響順序是碳源濃度>氮源濃度>pH值.菌絲體產生物量的最優(yōu)組合為：A2B2C2.由此可知，碳源濃度對茯苓菌絲體產量的影響最大，其次為氮源濃度，而培養(yǎng)基初始pH值影響最小.

2.4.2 以菌絲體干重為指標，液體接種方式的正交試驗 采用液體接種方式按6％的接種比例接液體種，搖床培養(yǎng)6 d，以菌絲體干重為指標，正交試驗結果及分析如表5.

表5 液體接種的正交試驗結果與分析

由表5可知，RA>RB>RC.說明3因素對液體接種培養(yǎng)菌絲體生物量的影響順序是碳源濃度>氮源濃度>pH值.菌絲體產生物量的最優(yōu)組合為：A2B2C2.由此可知，碳源濃度對茯苓產量的影響最大，其次為氮源濃度，而初始pH值影響最小.

2.4.3 以胞外多糖為指標，液體接種方式的正交試驗 采用液體接種方式按6％的接種比例接液體種，搖床培養(yǎng)6 d以胞外多糖含量為指標，正交試驗結果及分析如表6.

表6 液體接種的正交試驗結果與分析(以胞外多糖為指標)

由表6可知，RA>RB>RC.說明3因素對液體接種培養(yǎng)的菌絲體胞外多糖含量的影響順序是碳源濃度>氮源濃度>pH值.菌絲體胞外多糖積累的最優(yōu)組合為：A3B3C1.由此可知，碳源濃度對茯苓胞外多糖產量的影響最大，其次為氮源濃度，而初始pH值影響最小.

2.5 菌絲球的形態(tài)觀察

本試驗對固體接種方式液體培養(yǎng)后期的茯苓菌絲球進行了顯微觀察，結果顯示發(fā)育較充分的圓形菌絲球有一個明顯中央核，外層菌毛區(qū)菌絲長度較長而且密度較大.而不規(guī)則的菌絲球的核并不像前者那么明顯.在整個發(fā)酵過程中，菌絲球直徑并不是都一樣的，分別對其進行染色、制片觀察，可知直徑為1、2 mm的菌絲球著色均勻，說明菌絲的生活力強.直徑為5 mm的菌絲球核出現(xiàn)著色不均勻的現(xiàn)象.而在發(fā)酵過程中由于轉速或粘度等的影響會產生非球形的大菌塊，其中間的菌絲不易著色[8].

3 討 論

通過比較接種量、接種方式、碳源、氮源、初始pH值等因素對茯苓的菌絲體產量和胞外多糖產量的影響，結果表明：其作用大小是碳源>氮源>初始pH值.以菌絲干重為指標，茯苓液體發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基中：最適碳源為葡萄糖(3％,質量分數(shù)，下同)，最適氮源為酵母浸膏(0.51％)和蛋白胨(0.4％)，最適初始pH值為5.5.以多糖為指標，茯苓液體發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基中：最適碳源為葡萄糖(3.5％)，最適氮源為酵母浸膏(0.637％)和蛋白胨(0.5％)，最適初始pH值為5.0.茯苓菌絲球的形態(tài)觀察結果顯示菌絲球直徑大小、菌絲球中央核的大小及其染色均勻程度等都會影響到菌絲的生長速度，從而影響生物量[8].

在茯苓液體發(fā)酵過程中，采取液體接種具有生產周期短、菌絲發(fā)育點多、接種后菌絲蔓延迅速、菌齡整齊等特點，所以可以采用液體接種方式對茯苓進行液體培養(yǎng)或用于制備用于茯苓栽培的液體菌種.茯苓發(fā)酵終點的判斷還需深入研究，目前多數(shù)真菌發(fā)酵主要依據(jù)菌絲體的產量、培養(yǎng)液中的pH值、還原糖、含氮量、培養(yǎng)液的顏色變化以及菌絲球的形態(tài)變化等來判斷[1,9].茯苓液體發(fā)酵過程中的C、N消耗、pH值需進行動態(tài)檢測，并結合菌絲球的形態(tài)變化等，確定發(fā)酵終點.另外，在液體培養(yǎng)過程中，由于營養(yǎng)成分的消耗會使菌絲球的生長受到影響，也可以采用補料的方式[10]，提供其足夠的營養(yǎng)物質，延長發(fā)酵時間，來提高茯苓菌絲體及其胞外多糖的產量.

當然，繼續(xù)選育適于液體培養(yǎng)的高產茯苓菌株也是今后應進一步研究的課題[11].李慧等[4]報道無機碳源與有機碳源和無機氮源與有機氮源配合使用，有利于茯苓菌絲體大量生長繁殖，并可誘導促進茯苓多糖的產生和積累,為此，茯苓液體培養(yǎng)的優(yōu)化工作還需繼續(xù)探索下去.

參考文獻：

[1]林樹錢.中國藥用菌生產與產品開發(fā)[M].北京：中國農業(yè)出版社：204-206,316-317．

[2]林雨露，張俐娜，金勇，等.人工培養(yǎng)菌種茯苓菌絲體多糖的分離、組成和分子量[J].高分子學報，2003(1)：97-103.

[3]李羿，萬德光，裴瑾，等.茯苓液體發(fā)酵條件的研究[J].成都中醫(yī)藥大學學報,2005,28(1):52-55.

[4]李慧,常景玲.茯苓多糖發(fā)酵工藝的優(yōu)化[J].安徽農業(yè)科學,2006，34(5)：920-921.

[5]邵偉,樂超銀,熊澤,等.茯苓液體發(fā)酵條件的研究[J].食用菌，1999,4:2-3.

[6]胡國元,李偉偉.富硒金針菇深層培養(yǎng)研究[J].湖北民族學院學報,2002,18(2):21-23.

[7]張惟杰.糖復合物生化研究技術[M].杭州:浙江大學出版社,1998：11-12.

[8]雷德柱.灰樹花菌絲的深層發(fā)酵及其多糖的研究[D].廣州：華南理工大學，2001.

[9]陶文沂,敖宗華,許泓瑜,等.藥食用真菌生物技術[M].北京：化學工業(yè)出版社，2007：59-60.

[10]李羿，萬德光，楊勝．茯苓搖瓶補料發(fā)酵和發(fā)酵罐補料發(fā)酵[J]．成都中醫(yī)藥大學學報,2006,1(1):55-57.

[11]衛(wèi)軍，黃鶴，王麗娟，等.茯苓液體發(fā)酵條件研究及保健飲料研制[J].食品研究與開發(fā),2006,27(5):85-88.