王煥麗 張錫寶 陳興平

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院皮膚科，武漢430030;2.廣州市皮膚病防治所，廣州510095)

白念珠菌是重要的條件致病菌，易于黏附在醫(yī)學(xué)植入材料表面，包裹在自身產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)中形成生物膜，具有高度耐藥性，給治療帶來困難［1］。大蒜素(Allicin)又名大蒜新素，化學(xué)名二烯丙基三硫化物(CH2=CH-CH2-S-S-S-CH2-CH=CH2)，是從蒜的球形鱗莖中提取的揮發(fā)性油狀物，已證實(shí)有卓越的抗病原微生物、提高機(jī)體免疫功能等功效［2］。本文就大蒜素對(duì)白念珠菌生物膜形成、細(xì)胞黏附、芽管形成的影響進(jìn)行了初步研究，以期為白念珠菌生物膜的預(yù)防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(由南京皮研所惠贈(zèng)，編號(hào)為Y01:09)，大蒜素注射液(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司)，MTT(Sigama公司)，DMSO(Sigama公司)，新生牛血清 (Gibico公司)，RPMI-1640液體培養(yǎng)基 (Gibico公司)，YPD液體培養(yǎng)基和沙堡弱培養(yǎng)基根據(jù)文獻(xiàn)［3］配制和保存。

1.2 方法

大蒜素對(duì)白念珠菌最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 依據(jù)美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì) (現(xiàn)稱臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所，CLSI)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方案［4］，采用棋盤微量稀釋法，測(cè)定大蒜素對(duì)白念珠菌的MIC。

白念珠菌生物膜的制備 取白念珠菌單菌落，接種至YPD培養(yǎng)基中，37℃、50 r/min搖床培養(yǎng)18 h，離心收集菌體，用YPD培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為106cfu/mL，取100μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h(黏附階段)后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，每孔加入100μL YPD培養(yǎng)基，作為培養(yǎng)的0點(diǎn)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h更換1次培養(yǎng)液［5-6］。

MTT法檢測(cè)不同濃度大蒜素對(duì)白念珠菌生物膜形成的影響 在生物膜培養(yǎng)的0點(diǎn)，加入倍比稀釋的大蒜素溶液 (終濃度分別為4～64μg/mL)，空白對(duì)照孔加入培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，每孔加入100μL PBS及20 μL 5 mg/mL MTT，37℃避光孵育4 h后棄去上清，每孔加入100μL DMSO，30 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定其在490 nm波長(zhǎng)處的OD值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。倒置顯微鏡下觀察大蒜素對(duì)白念珠菌生物膜的形態(tài)影響。

MTT法檢測(cè)大蒜素對(duì)不同生長(zhǎng)階段白念珠菌生物膜的影響 分別在生物膜培養(yǎng)的0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h棄去培養(yǎng)液，加入100 μL YPD 培養(yǎng)基及100μL終濃度為32μg/mL的大蒜素溶液，空白對(duì)照孔加入200μL YPD培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。MTT法測(cè)量各孔在490 nm波長(zhǎng)處的OD值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

MTT法檢測(cè)不同濃度大蒜素對(duì)白念珠菌細(xì)胞黏附的影響 將100μL濃度為106cfu/mL的菌液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入倍比稀釋的100μL大蒜素溶液 (終濃度分別為4～32μg/mL)，空白對(duì)照孔加入培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)。分別培養(yǎng)30 min，60 min，90 min 和120 min，MTT 法測(cè)量各孔在490 nm波長(zhǎng)處的OD值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

血清芽管計(jì)數(shù)法檢測(cè)不同濃度大蒜素對(duì)白念珠菌芽管形成的影響 將100μL濃度為106cfu/mL的菌懸液及50μL終濃度為5%的新生牛血清加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，各處理孔按倍比稀釋法加入50μL大蒜素溶液 (終濃度為4～64μg/mL)，空白對(duì)照孔加入50μL YPD液體培養(yǎng)基，37℃、30 r/min搖床培養(yǎng)2 h，光鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)白念珠菌酵母細(xì)胞的出芽情況。

MTT法檢測(cè)不同濃度大蒜素預(yù)處理96孔板對(duì)白念珠菌生物膜形成的影響 將100μL倍比稀釋的大蒜素溶液(4～64μg/mL)分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，空白對(duì)照組加入生理鹽水，4℃過夜。加入菌液前棄去處理液，進(jìn)行生物膜培養(yǎng)48 h。MTT法對(duì)生物膜的形成進(jìn)行檢測(cè)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用珋x±s表示，用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行分析，兩組間比較用配對(duì)t檢驗(yàn)分析，多組間兩兩比較用方差分析，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 大蒜素對(duì)白念珠菌的MIC

大蒜素對(duì)白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Y01:09的MIC為16μg/mL。

2.2 不同濃度大蒜素對(duì)白念珠菌生物膜形成的影響

大蒜素對(duì)白念珠菌生物膜的形成具有抑制作用，呈濃度相關(guān)性，抑制率隨大蒜素濃度增高而增高，各濃度組間有顯著性差異(P ＜0.01，見表1)。

表1 不同濃度大蒜素對(duì)白念珠菌生物膜形成的相對(duì)抑制率(珋x±s，n=9)Tab.1 Relative inhibitive rate of different concentration of allicin in C.albicans biofilm formation(珋x±s，n=9)

倒置顯微鏡下，空白對(duì)照組可見酵母細(xì)胞、菌絲、假菌絲包裹在細(xì)胞外基質(zhì)中形成的密集的生物膜;8μg/mL大蒜素組形成的生物膜稀疏，主要由芽生孢子組成，見少量芽管樣結(jié)構(gòu)，但未形成典型菌絲及假菌絲;64μg/mL大蒜素組未見典型生物膜結(jié)構(gòu)，只出現(xiàn)少量的酵母細(xì)胞(見圖1)。

圖1 不同濃度大蒜素對(duì)白念珠菌生物膜形成的形態(tài)學(xué)影響(倒置顯微鏡×200):a.空白對(duì)照組，b.8μg/mL大蒜素組，c.64μg/mL大蒜素組Fig.1 Effect of different concentration of allicin on C.albicans biofilm morphology(inverted microscope，×200):a.control，b.8 μg/mL allicin，c.64 μg/mL allicin

2.3 大蒜素對(duì)不同生長(zhǎng)階段白念珠菌生物膜的影響

大蒜素對(duì)不同生長(zhǎng)階段的白念珠菌生物膜均有抑制作用，且呈時(shí)間相關(guān)性，抑制率隨生物膜的成熟逐漸降低，各生長(zhǎng)階段組間有顯著性差異(P＜0.01，見表2)。

表2 大蒜素對(duì)不同生長(zhǎng)階段白念珠菌生物膜的影響(珋x±s，n=9)Tab.2 Effect of allicin on different stages of C.albicans biofilm(珋x ± s，n=9)

2.4 不同濃度大蒜素對(duì)白念珠菌細(xì)胞黏附的影響

與空白對(duì)照組相比，不同濃度大蒜素對(duì)培養(yǎng)30 min、60 min、90 min、120 min 的白念珠菌細(xì)胞黏附均有明顯抑制作用 (P ＜0.05，見表3)。

2.5 不同濃度大蒜素對(duì)白念珠菌芽管形成的影響

大蒜素具有明顯抑制白念珠菌芽管形成的作用，芽管形成率隨大蒜素濃度的增高逐漸降低，各濃度組間有顯著性差異 (P ＜0.01，見表4)。

2.6 不同濃度大蒜素預(yù)處理96孔板對(duì)白念珠菌生物膜形成的影響

大蒜素預(yù)處理的孔形成的生物膜代謝活性有所降低，但4μg/mL和8μg/mL組與空白對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P ＞0.05)，而16μg/mL、32 μg/mL和64μg/mL與空白對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P ＜0.05，見表5)。

表3 不同濃度大蒜素對(duì)各黏附階段白念珠菌生物膜OD值的影響(x珋±s，n=9)Tab.3 Effect of different concentration of allicin on OD value of C.albicans biofilm during different stages of adhesion(x珋±s，n=9)

表4 不同濃度大蒜素對(duì)白念珠菌芽管形成的影響(珋x±s，n=9)Tab.4 Effect of different concentration of allicin on germ tube formation of C.albicans(珋x±s，n=9)

表5 不同濃度大蒜素預(yù)處理96孔板對(duì)白念珠菌生物膜的影響(珋x±s，n=9)Tab.5 Effect of different concentration of allicin on C.albicans biofilm formation in pretreatment of 96-well plates(珋x±s，n=9)

3 討 論

Chandra等［7］發(fā)現(xiàn)白念珠菌生物膜的形成分為3個(gè)階段:早期 (0～11 h)，中期 (12～30 h)和成熟期 (38～72 h)。早期以白念珠菌增殖及菌落的形成為主，到中晚期以非細(xì)胞物質(zhì)的出現(xiàn)為特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大蒜素能抑制白念珠菌生物膜的形成，呈濃度相關(guān)性，且對(duì)其形成的三個(gè)階段均有明顯的抑制作用，尤其是早期階段抑制作用顯著，提示早期、足量使用大蒜素，對(duì)醫(yī)學(xué)植入材料相關(guān)白念珠菌生物膜的預(yù)防和治療可能具有一定的作用。

細(xì)胞黏附是生物膜形成的第一步，對(duì)生物膜的形成尤為重要，且其黏附到宿主細(xì)胞表面是其致病的首要條件［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素對(duì)白念珠菌黏附有較明顯的抑制作用，提示大蒜素對(duì)生物膜形成的抑制作用可能與其抑制白念珠菌的細(xì)胞黏附有關(guān)。

白念珠菌是具有酵母及菌絲二相性的真核微生物，菌絲相對(duì)宿主的黏附和侵襲能力強(qiáng)，而酵母相毒力很小。酵母相轉(zhuǎn)變?yōu)榫z相過程中形成芽管，是該菌由定植菌向致病菌轉(zhuǎn)變的標(biāo)志。Rodrigues等［9］發(fā)現(xiàn)白念珠菌酵母相是親水性的，但當(dāng)芽管形成后明顯增加了細(xì)胞表面的疏水性，Li等［10］認(rèn)為白念珠菌生物膜的形成能力與細(xì)胞表面疏水性呈正相關(guān)。由此推測(cè)白念珠菌芽管形成可促進(jìn)其生物膜的形成。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大蒜素能明顯抑制白念珠菌芽管的形成，從而抑制菌絲的形成，從形態(tài)學(xué)上進(jìn)一步驗(yàn)證了大蒜素對(duì)白念珠菌生物膜的影響。提示一定濃度的大蒜素能通過抑制白念珠菌的芽管形成進(jìn)而抑制其生物膜的形成及致病性。

生物材料用抗真菌劑包裹能抑制白念珠菌生物膜的形成，原因可能是表面修飾抑制了真菌細(xì)胞的黏附，藥物從生物材料中釋放也可對(duì)生物膜的形成產(chǎn)生直接抑制作用。這種措施在預(yù)防生物膜相關(guān)感染中發(fā)揮重要作用，且已成功應(yīng)用到導(dǎo)管相關(guān)菌血癥的防治中［11］。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度大蒜素預(yù)處理96孔板，發(fā)現(xiàn)處理組生物膜活性較對(duì)照組均降低，且在較高濃度組有顯著性差異。

鑒于生物膜感染的難治性，人們對(duì)白念珠菌生物膜及其形成的抑制性因素進(jìn)行了廣泛研究，期望尋找出高效實(shí)用的防治白念珠菌生物膜的方法。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)大蒜素具有體外抗白念珠菌生物膜的功能，為白念珠菌生物膜的防治提供了新思路。但由于生物膜形成的影響因素復(fù)雜，白念珠菌的自然譜系和同源細(xì)胞譜系均在生物膜形成能力方面顯示出巨大的差異［10］，且目前對(duì)白念珠菌生物膜及其形成的抑制性因素所做的研究大部分是在體外條件下完成的，而體內(nèi)環(huán)境與體外環(huán)境差別很大，因此尋找出有效實(shí)用的防治白念珠菌生物膜的方法任重道遠(yuǎn)。

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