郭全興， 劉亞蓉， 楊鳳梅， 高占魁

（1.青海省藥品檢驗(yàn)所，青海西寧 810016;2.青海寶鑒堂國(guó)藥有限公司，青海西寧 810016）

山莨菪麝香膏為青海寶鑒堂國(guó)藥有限公司（前身為青海省海北制藥廠）研制的新藥。收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十三冊(cè)中。具有活血鎮(zhèn)痛，祛風(fēng)除濕的功效。用于風(fēng)濕痹痛，關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，跌打損傷等癥的疼痛［1］。原部頒標(biāo)準(zhǔn)中僅有唐古特瑞香的紙層析鑒別（祖師麻甲素）和膏劑的常規(guī)檢查項(xiàng)。無含量測(cè)定內(nèi)容。為了更全面的控制該產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)方中君藥唐古特瑞香進(jìn)行了含量測(cè)定研究，對(duì)方中其他藥味進(jìn)行了鑒別研究，并對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)中唐古特瑞香的紙層析鑒別方法進(jìn)行了修訂。試驗(yàn)證明，方法簡(jiǎn)便快捷，專屬性強(qiáng)，結(jié)果滿意。

1 儀器和試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent G1314 VWD紫外檢測(cè)器，HP化學(xué)工作站（美國(guó)Aglient公司）;CP-3800瓦里安氣相色譜儀;CP-8410全自動(dòng)進(jìn)樣器;FID檢測(cè)器;CP-Wax毛細(xì)管柱;電子天平（Sartorius BT224S，北京賽多力斯儀器公司）;超聲波清洗器（B2500s-MT，上海必能信超聲波清洗儀有限公司）。

祖師麻甲素對(duì)照品（批號(hào)110900-200405，含量測(cè)定用）;樟腦對(duì)照品（747-2001060;供含測(cè)）;龍腦對(duì)照品（110881-200202，供含測(cè)）;水楊酸甲酯（110707-200107）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;甲醇、乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純;水為重蒸餾水。

山莨菪麝香膏 3批（批號(hào):XJ630062、XJ630060、XJ630083）及有關(guān)陰性對(duì)照樣品均由青海寶鑒堂國(guó)藥有限公司提供。

2 定性鑒別

2.1 TLC法鑒別唐古特瑞香 取本品140 cm2，加乙酸乙酯30 mL，加熱回流30 min，提取液轉(zhuǎn)至分液漏斗中，用4%氫氧化鈉溶液，提取3次，每次10 mL，合并提取液，以稀鹽酸酸化至pH值1～2，再以乙酸乙酯提取3次，每次10 mL，合并提取液，濃縮至10 mL，作為供試品溶液。取祖師麻甲素對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取缺唐古特瑞香的陰性對(duì)照樣品，同供試品溶液制備法制得陰性對(duì)照溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板 （青島海洋化工廠）上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-乙醚（10∶1∶1∶3）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以三氯化鐵試液，日光下檢視，3批供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾。見圖1。

圖1 唐古特瑞香TLC鑒別圖

2.2 GC法鑒別樟腦、冰片、水楊酸甲酯［2］色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱:CP-Wax 52 CB毛細(xì)管柱（長(zhǎng)度30 m，內(nèi)徑:0.25 mm，膜厚0.25 μm），柱溫:130 ℃，載氣氮?dú)?30 mL/min，檢測(cè)器:FID。

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品橡膠膏1片（約70 cm2），除去塑料，精密量取面積，剪成條狀，置揮發(fā)油測(cè)定器中，自上端加水8 mL，再加乙酸乙酯2 mL，連接冷凝管，加熱回流提取4 h，冷至室溫，分取揮發(fā)油測(cè)定器中的乙酸乙酯層，置10 mL量瓶中，用乙酸乙酯洗滌揮發(fā)油測(cè)定器，洗液并入量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取樟腦對(duì)照品0.051 00 g，置5 mL量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，作為樟腦貯備液;精密稱取龍腦對(duì)照品0.066 85 g，置5 mL量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，作為龍腦貯備液;精密稱取水楊酸甲酯對(duì)照品1.081 62 g，置100 mL量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，作為水楊酸甲酯貯備液。精密吸取樟腦、龍腦、水楊酸甲酯貯備液各1 mL，置10 mL量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例稱取除樟腦、龍腦、水楊酸甲酯以外的其他藥材適量，依照山莨菪麝香膏的制備工藝和供試品溶液的制備方法，制得陰性對(duì)照溶液。

測(cè)定法分別精密吸取上述3種對(duì)照品貯備液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各1 μL，注入氣相色譜儀中，在上述色譜條件下測(cè)定。

結(jié)果:從圖譜上分析，3種成分在毛細(xì)管柱上可得到很好的分離，專屬性和重現(xiàn)性強(qiáng)，認(rèn)為可作為山莨菪麝香膏中樟腦、冰片、水楊酸甲酯的定性鑒別方法。結(jié)果見圖2。

圖2 GC色譜圖

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件 色譜柱 依利特Hypersil ODS2，5 μm 4.6 mm×250 mm柱;乙腈-0.4%磷酸溶液（22∶78）為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm;理論塔板數(shù)按祖師麻甲素計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取祖師麻甲素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含11.57 μg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備 取本品1 g（批號(hào)XJ630062），精密稱定，置燒杯中，加水煎煮3次，每次80 mL，煎煮40 min，合并煎煮液，過濾，放冷，用石油醚（60～90℃）洗滌2次，每次30 mL，水液蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移到25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

3.4 陰性對(duì)照試驗(yàn) 按照處方組成，取除唐古特瑞香以外的其余藥味，按制備工藝要求制成不含唐古特瑞香的制劑，按供試品溶液制備項(xiàng)下的方法制備陰性對(duì)照溶液。在本試驗(yàn)擬定的色譜條件下測(cè)定，結(jié)果表明，其他成分對(duì)祖師麻甲素的測(cè)定無干擾，HPLC色譜圖見圖3。

3.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液（11.57 μg/mL）4、8、12、16、20 μL，按上述條件分別注入色譜儀測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程Y=39.694X+6.129 9，r=0.999 6（n=5），祖師麻甲素進(jìn)樣量在0.046 3 μg～0.231 4 μg范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系。

3.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，按色譜條件操作進(jìn)行，測(cè)峰面積，以峰面積計(jì)算RSD=1.4%，測(cè)定方法精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述供試品溶液（批號(hào)XJ630062）分別在 0、2、4、6、8 h 進(jìn)行，進(jìn)樣量 10 μL，測(cè)定祖師麻甲素峰面積，以峰面積計(jì)算RSD=1.0%，說明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖3HPLC色譜圖

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按照上述含量測(cè)定方法對(duì)相同批號(hào)樣品（批號(hào):XJ630062）制備5份供試液，分別進(jìn)樣10μL，測(cè)得峰面積，計(jì)算RSD=2.4%，說明本方法重現(xiàn)性良好。

3.9 回收率試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)XJ630062）9份，每份取約0.5 g，精密稱定，分別精密加入祖師麻甲素對(duì)照品（0.112 4 mg/g）1.5、1.0、0.8 mL，按正文中供試品溶液的制備方法制備，依法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率95.4%，RSD=0.5%。結(jié)果表明本方法加樣回收較好。見表1。

表1 祖師麻甲素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

本品由于劑型限制，橡膠對(duì)提取造成較大困難，故加樣回收率偏低，但考慮到本品為外用制劑，且此含量測(cè)定方法重現(xiàn)性較好、方法穩(wěn)定，認(rèn)為可以控制藥品質(zhì)量。

3.10 樣品測(cè)定結(jié)果 按本實(shí)驗(yàn)含量測(cè)定方法，對(duì)10批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 10批樣品祖師麻甲素含測(cè)結(jié)果（n=4）

4 討論

4.1 原標(biāo)準(zhǔn)中唐古特瑞香鑒別采用紙色譜法，結(jié)果色譜斑點(diǎn)大而散，背景干擾較嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)對(duì)原方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用薄層色譜法進(jìn)行鑒別，斑點(diǎn)清晰，陰性無干擾。

4.2 方中唐古特瑞香為藏族民間用藥，其祛風(fēng)除濕、活血化瘀、抗炎鎮(zhèn)痛的主要有效成分為瑞香素（daphnetin），即祖師麻甲素，又名瑞香內(nèi)酯（7，8-二羥基香豆素）［3］。有文獻(xiàn)報(bào)道用HPLC法測(cè)定唐古特瑞香中祖師麻甲素的含量［4］，本試驗(yàn)進(jìn)行了參考，但本品為橡膠膏，由于劑型特點(diǎn)，提取難度較大，樣品中祖師麻甲素不易提取完全，提取液中殘留橡膠對(duì)色譜柱損傷較大，所以我們對(duì)供試品的提取進(jìn)行了多方面的考察，最終確定采用水煎煮提取方法。

4.3 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［5］，對(duì)方中人工麝香進(jìn)行了GC定量研究，但由于方中人工麝香處方量極低，僅為處方量的0.195/100 0，且本品為外用貼膏劑，基質(zhì)為天然橡膠，藥材粉末及提取物最后加入基質(zhì)共同入攪拌，制得。故從制劑中提取極為困難，GC幾乎檢測(cè)不到麝香酮的峰。顯微鑒別也因基質(zhì)影響而無法檢測(cè)。

4.4 參照文獻(xiàn)方法［6］對(duì)方中山莨菪進(jìn)行了TLC鑒別研究，因?yàn)殛幮愿蓴_較大，無法收入正文。

4.5 對(duì)方中冰片、樟腦、水楊酸甲酯進(jìn)行了氣相色譜的含量測(cè)定研究。實(shí)驗(yàn)表明，樣品中3種成分可以得到很好的分離，但同批樣品中的冰片（以龍腦計(jì)）、樟腦、水楊酸甲酯含量不均一，差異大，無法做加樣回收試驗(yàn);樣品的穩(wěn)定性、精密度也差。分析原因，一是由于樣品涂布不均勻?qū)е?二是在生產(chǎn)過程中，烘干等工序使得樟腦、龍腦、水楊酸甲酯都有不同程度的損失。故只將上述3種成分進(jìn)行GC法定性鑒別，含量測(cè)定暫不列入正文，我們今后將繼續(xù)對(duì)這3種成分進(jìn)行含量測(cè)定研究。

［1］衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十三冊(cè)［S］.1997:22.

［2］江 生，張小松，毛 慶.GC同時(shí)測(cè)定消炎鎮(zhèn)痛膏中的樟腦、薄荷腦、龍腦和水楊酸甲酯［J］.華西藥學(xué)雜志，2008，23（6）:706-707.

［3］王明時(shí)，劉衛(wèi)國(guó)，忻莉娟.唐古特瑞香化學(xué)成分的研究［J］.南京藥學(xué)院學(xué)報(bào)，1984，15（2）:1-5.

［4］劉亞蓉.HPLC測(cè)定唐古特瑞香中祖師麻甲素的含量［J］.陜西中醫(yī)，2009，30（1）:85-87.

［5］梁 穎，汪小根.GC-MS法初步分析天然麝香與人工麝香［J］.中藥新藥與臨床藥理［J］.2005，16（3）:204-205.

［6］王 環(huán)，張曉峰，陳桂琛，等.人工栽培山莨菪和野生山莨菪中4種托烷類生物堿含量的比較研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2005，25（3）:575-577.