吳 畏，孟德勝，傅若秋，溫 悅，趙艷艷，李卓恒，婁 海，盧來春（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院藥劑科，重慶市 400042）

貫葉連翹（Hypericum perforatum）為藤黃科金絲桃屬植物[1]，是2005年版《中國藥典》新增國際研究熱點品種[2]。其主要活性成分金絲桃素具有光敏活性和光動力作用，有較好的抗病毒、抗腫瘤功效，同時也是貫葉連翹抗抑郁的主要活性成分之一[3，4]。在我國，貫葉連翹廣泛分布于河南、河北、山東、甘肅、四川、云南等地，由于氣候、水質(zhì)等差異，各地品種質(zhì)量均有差異。因此，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測定不同產(chǎn)地貫葉連翹不同部位中金絲桃素的含量，以期為評價貫葉連翹的質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-10Atvp型HPLC儀、SPD-10A型紫外-可見光檢測器（日本Shimadzu公司）；十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；RE-201c型恒溫水油浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限公司）；KQ-500E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器廠）。

1.2 試藥

金絲桃素標準品（成都普瑞法科技開發(fā)公司，純度：99.1%，批號：081204）；甲醇（色譜純，韓國SK Chemicals）；水為純化水，無水乙醇、氨水均為分析純；貫葉連翹藥材購自重慶慧遠藥業(yè)有限公司，分別產(chǎn)自云南、四川、甘肅，均為2008年產(chǎn)，經(jīng)重慶市藥品檢驗所鑒定均為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Boston pHlex ODS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（85 ∶15，氨水調(diào)pH 9.5）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：588 nm；進樣量：20 μL。在此色譜條件下，金絲桃素與提取物中其它成分有較好的分離度。色譜見圖1。

2.2 標準品貯備液的制備

精密稱取金絲桃素標準品9.01 mg，溶于20 mL二甲基亞砜中，再轉(zhuǎn)入250 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，精密吸取1.00 mL，置于10.0 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容，制備成濃度為3.60 μg·mL-1的標準品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取不同產(chǎn)地貫葉連翹的不同部位各5.0 g，剪碎，置于燒瓶中，加入100 mL無水乙醇，超聲波提取10 min；再放入80℃水浴鍋中，避光回流2 h，抽濾，濾液避光保存；濾渣加50 mL無水乙醇重復(fù)回流提取2次，合并濾液，80℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液溶解于10.0 mL二甲基亞砜中，轉(zhuǎn)移至50.0 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，得樣品提取液。吸取適量（各產(chǎn)地藥材花、葉部位提取液0.10 mL，甘肅產(chǎn)藥材莖部位提取液1.00 mL，四川和云南產(chǎn)藥材莖部位提取液10.00 mL），置于10.00 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，10000 r·min-1離心10 min，取上清液，即得不同產(chǎn)地貫葉連翹不同部位供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備

取適量無水乙醇置于燒瓶中，按照“2.3”項下方法自“超聲波提取10 min”起操作，制成陰性對照溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取上述標準品貯備液0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，分別置于5.00 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容，得不同濃度的標準品溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣，每個濃度3次，每次進樣20 μL，測定峰面積積分值。以檢測濃度（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，制備標準曲線，得回歸方程為Y＝59503X+1266（r＝0.9997）。結(jié)果表明，金絲桃素檢測濃度在0.14～3.60 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗

精密量取標準品貯備液1.00 mL，置于5.0 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容，按“2.1”項下色譜條件進樣20 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果，RSD＝1.82%，表明儀器精密度良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗

取同一產(chǎn)地同一部位（甘肅產(chǎn)藥材花、葉部位）藥材，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定。結(jié)果，RSD＝1.83%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，在0、1、2、3、4 h時間點分別進樣分析。結(jié)果，金絲桃素峰面積基本不變，RSD＝1.97%，表明供試品溶液在4 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗

吸取已知含量的同一產(chǎn)地同一部位（甘肅藥材花、葉部位）藥材提取液6份，每份含金絲桃素約2.8 mg，分別精密加入相應(yīng)含量的金絲桃素標準品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取3個產(chǎn)地的貫葉連翹藥材，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地貫葉連翹不同部位中金絲桃素含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Content determination of hypericin in different parts of H.perforatum from different habitats（n＝3）

3 討論

由表2可知，不同產(chǎn)地貫葉連翹的不同部位中，金絲桃素的含量差異很大：甘肅產(chǎn)貫葉連翹花、葉與莖部位金絲桃素含量最高，四川產(chǎn)含量次之，云南產(chǎn)最低；而同一產(chǎn)地貫葉連翹中，莖部位金絲桃素含量均低于花、葉部位。故在臨床或科研應(yīng)用中，建議采用貫葉連翹植物花、葉及莖上半部分入藥。

由于不同產(chǎn)地不同部位貫葉連翹中金絲桃素含量差別較大，重現(xiàn)性的RSD也均不同。其中，莖部位金絲桃素含量測定的RSD均＞7%，最大可達到12%。由此推測：除了莖部位金絲桃素含量低造成的誤差，很有可能是由于莖的上部與下部的含量差異大，造成每次取材質(zhì)量無法均一。

金絲桃素為萘駢二蒽酮類結(jié)構(gòu)，微溶于甲醇，其甲醇溶液作吸收波長掃描，在588 nm波長處有較強吸收，故選擇可見光區(qū)的588 nm作為檢測波長。

金絲桃素在酸性溶液中溶解度極低。筆者對比了酸性和堿性流動相，發(fā)現(xiàn)采用酸性流動相時金絲桃素主峰保留時間在40 min以后，洗脫效果較差；而采用氨水調(diào)流動相pH值至弱堿性可增加金絲桃素在流動相的溶解性，優(yōu)化分離效果，主峰保留時間在9.5 min左右，故流動相采用甲醇-水（85∶15，氨水調(diào)pH 9.5）。

綜上，本方法簡便、準確、重現(xiàn)性好，可用于貫葉連翹的質(zhì)量控制。

[1]高 穎.貫葉連翹提取物的藥理活性研究進展[J].吉林醫(yī)學(xué)，2008，29（21）：1954.

[2]費 曜，劉 新，王文蘋.2005年版《中國藥典》（公示稿）中藥材部分修訂動向[J].中國藥房，2005，16（4）：314.

[3]白 潔，楊得坡.金絲桃素光動力學(xué)療法與其誘導(dǎo)細胞凋亡、抗凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[J].中草藥，2004，35（1）：106.

[4]C Quiney，C Billard，P Mirshahi，et al.Hyperforin inhibits MMP-9 secretion by B-CLL cells and microtubule formation by endothelial cells[J].Leukemia，2006，20（1）：583.