高文平，楊大堅(jiān)，胡四琴，鄒德學(xué)，曾薇，徐彷周，郭靜，袁勁松#（.北京大學(xué)深圳醫(yī)院，深圳市 5806；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，汕頭市 5504；.香港理工大學(xué)深圳研究院，深圳市 5806）

檳榔（Areca catechu L.）是棕櫚科植物檳榔的干燥成熟種子，是一種常用中藥，位居我國(guó)著名四大南藥之首。檳榔嚼塊是檳榔果實(shí)或果實(shí)與其它添加物混合的咀嚼物，目前全世界約有6億人咀嚼檳榔嚼塊。有研究表明，檳榔嚼塊的流行與致癌、致突變、神經(jīng)精神毒性、生殖毒性等有關(guān)[1]。生物堿是檳榔果實(shí)的主要活性成分，而研究檳榔堿對(duì)人精子質(zhì)量影響的報(bào)道較少。本試驗(yàn)優(yōu)選正常男性精子與不同濃度檳榔堿溶液共孵育，采用計(jì)算機(jī)輔助的精子分析系統(tǒng)（CASA）觀察不同濃度檳榔堿溶液對(duì)人精子活率、活力、速度等指標(biāo)的影響。

1 材料

1.1 儀器

CASA（北京清華同方軟件股份有限公司）；DK-8A型電熱恒溫水槽（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；0412-1型MACRO精子計(jì)數(shù)板（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

小牛血清白蛋白（BSA，美國(guó)Sigma公司）、Ham's F10培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）；氫溴酸檳榔堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111684-200401）。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)本收集

按WHO推薦的試驗(yàn)方法及標(biāo)準(zhǔn)[2]，從本院男科門(mén)診送檢的精液標(biāo)本中，收集50例正常成年男性精液。年齡22～30歲。取樣方法為：禁欲3～5 d，取樣前48 h禁飲酒和咖啡等對(duì)精子有影響的食物或藥物，手淫法收集標(biāo)本于干凈的容器并及時(shí)送驗(yàn)。

2.2 試液制備和精子優(yōu)選

2.2.1 精子優(yōu)選液的制備：取10 mL Ham's F10培養(yǎng)液，加入BSA 35 mg，調(diào)節(jié)pH值至7.4，用0.22 μm微孔薄膜過(guò)濾除菌，備用。

2.2.2 檳榔堿溶液的制備：取檳榔堿，用精子優(yōu)選液分別配制成10、50、100 μg·mL-1，調(diào)節(jié)滲透壓為290 mosm·kg-1的檳榔堿溶液。

2.2.3 精子優(yōu)選：按文獻(xiàn)方法[3]加以改良。取1支10 mL一次性醫(yī)用注射器，抽入2 mL空氣后再抽入精子優(yōu)選液2 mL，最后緩慢抽入精液1.5 mL，避免震動(dòng)，使精液與優(yōu)選液分界清楚，將注射器針頭護(hù)嘴套上，置注射器于37℃恒溫水浴箱內(nèi)的支架上固定（注射器按其內(nèi)部的優(yōu)選液和精液所呈現(xiàn)的交界面積最大的角度放置）。孵育45 min后緩慢直立，推棄優(yōu)選液下方的精液，收集富含優(yōu)選精子的優(yōu)選液，500 r·min-1離心5 min，吸棄離心管中的上清液，用新鮮的優(yōu)選液緩慢均勻吹散精子團(tuán)塊，并用新鮮的優(yōu)選液調(diào)節(jié)終濃度至（40～80）×106·mL-1。

2.3 分組與孵育

試驗(yàn)分為4組，即對(duì)照（精子優(yōu)選液）及檳榔堿高、中、低濃度（100、50、10 μg·mL-1）組。置于37 ℃恒溫水浴箱培養(yǎng)，分別孵育0.5、1和2 h。

2.4 CASA進(jìn)行分析

吸取充分混溶的孵化后的精子懸液10 μL，加到預(yù)溫的MACRO精子計(jì)數(shù)板的樣品槽中。將計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，采用20×反相物鏡選擇8個(gè)視野檢測(cè)，8個(gè)視野檢測(cè)的精子總數(shù)不少于300個(gè)精子，用顯微攝像機(jī)和錄像機(jī)記錄精子的運(yùn)動(dòng)圖像，進(jìn)行軟件處理，即得各運(yùn)動(dòng)參數(shù)：精子活率（Mot，%）、a+b級(jí)運(yùn)動(dòng)精子百分率[（a+b）PM，%]、曲線速度（VCL，μm·s-1）、直線速度（VSL，μm·s-1）。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.6 檳榔堿對(duì)人體外精子運(yùn)動(dòng)能力參數(shù)影響試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)CASA分析，不同時(shí)間段檳榔堿溶液對(duì)體外Mot有顯著影響，使Mot降低。與對(duì)照組比較，檳榔堿低濃度組1、2 h后Mot顯著下降（P＜0.01）；檳榔堿高、中濃度組0.5、1、2 h后Mot顯著下降（P＜0.01）。不同時(shí)間段檳榔堿溶液使（a+b）PM下降。與對(duì)照組比較，檳榔堿高、中濃度組0.5、1、2 h后（a+b）PM顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。與對(duì)照組比較，不同時(shí)間段高、中濃度組VCL顯著下降（P＜0.01）；檳榔堿低濃度組2 h后VCL顯著下降（P＜0.01）。不同時(shí)間段檳榔堿溶液使VSL下降。與對(duì)照組比較，檳榔堿高、中濃度組0.5、1、2 h后VSL均顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）?？梢?jiàn)，檳榔堿溶液在不同作用時(shí)間和不同作用濃度的情況下，精子各運(yùn)動(dòng)參數(shù)均有顯著性差異。檳榔堿濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，精子運(yùn)動(dòng)能力越低，從而說(shuō)明檳榔堿能降低正常男性體外精子運(yùn)動(dòng)能力且與濃度時(shí)間成正比。不同時(shí)間段檳榔堿溶液對(duì)Mot、（a+b）PM、VCL、VSL的影響分別見(jiàn)表1、表2、表3、表4。

表1 不同時(shí)間段檳榔堿溶液對(duì)Mot的影響（，n＝50）Tab 1 Influence of Ar solution on the Mot of sperm in different period（，n＝50）

表1 不同時(shí)間段檳榔堿溶液對(duì)Mot的影響（，n＝50）Tab 1 Influence of Ar solution on the Mot of sperm in different period（，n＝50）

與對(duì)照組比較：＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01

2時(shí)間/h 1組別對(duì)照組檳榔堿低濃度組檳榔堿中濃度組檳榔堿高濃度組59.13±6.5556.65±5.18＊54.85±9.79＊29.59±8.79＊濃度/μg·mL－1 010501000.569.80±5.2972.31±7.4061.72±7.97＊42.95±7.73＊66.87±6.1662.24±9.37＊58.43±7.78＊37.89±6.84＊

表2 不同時(shí)間段檳榔堿溶液對(duì)（a+b）PM的影響（，n＝50）Tab 2 Influence of Ar solution on the（a+b）PM of sperm in different period（，n＝50）

表2 不同時(shí)間段檳榔堿溶液對(duì)（a+b）PM的影響（，n＝50）Tab 2 Influence of Ar solution on the（a+b）PM of sperm in different period（，n＝50）

與對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2時(shí)間/h組別對(duì)照組檳榔堿低濃度組檳榔堿中濃度組檳榔堿高濃度組濃度/μg·mL－1 010501000.554.61±6.3153.74±4.1551.03±7.80＊35.44±9.57＊＊150.43±6.8347.66±8.1344.10±6.87＊＊29.69±8.15＊＊42.87±6.4041.38±7.3238.12±8.72＊＊22.82±7.59＊＊

表3 不同時(shí)間段檳榔堿溶液對(duì)VCL的影響（，n＝50）Tab 3 Influence of Ar solution on the VCL of sperm in different period（，n＝50）

表3 不同時(shí)間段檳榔堿溶液對(duì)VCL的影響（，n＝50）Tab 3 Influence of Ar solution on the VCL of sperm in different period（，n＝50）

與對(duì)照組比較：＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01

組別對(duì)照組檳榔堿低濃度組檳榔堿中濃度組檳榔堿高濃度組時(shí)間/h劑量/μg·mL－1 010501002124.70±3.3320.46±4.24＊13.71±6.03＊12.55±5.34＊0.530.79±3.9229.91±3.6928.49±4.53＊26.21±2.32＊27.32±3.8326.79±4.4422.94±3.31＊20.33±3.9＊

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的檳榔堿溶液，作用一定時(shí)間后，對(duì)正常人精子體外運(yùn)動(dòng)各參數(shù)均有影響。

表4 不同時(shí)間段檳榔堿溶液對(duì)VSL的影響（，n＝50）Tab 4 Influence of Ar solution on the VSL of sperm in different period（，n＝50）

表4 不同時(shí)間段檳榔堿溶液對(duì)VSL的影響（，n＝50）Tab 4 Influence of Ar solution on the VSL of sperm in different period（，n＝50）

與對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對(duì)照組檳榔堿低濃度組檳榔堿中濃度組檳榔堿高濃度組時(shí)間/h劑量/μg·mL－1 010501000.517.20±2.9716.66±3.6915.49±3.86＊＊10.24±2.37＊＊1213.00±3.9612.56±4.819.21±2.98＊＊7.97±2.85＊＊15.04±3.1213.74±4.0513.46±4.49＊10.24±2.37＊＊

近年來(lái)，男性不育成逐年遞增的趨勢(shì)，導(dǎo)致男性不育的原因主要有精子數(shù)目減少、精子活力或受精能力低下，而足夠的精子數(shù)量和適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)能力是男性生殖能力的重要保障，在毒理學(xué)上已將精子計(jì)數(shù)、精子形態(tài)以及精子活動(dòng)力作為男性生殖健康的重要判斷指標(biāo)[4]。藥源性生殖功能損害雖然不會(huì)威脅生命，但會(huì)影響性生活質(zhì)量和懷孕能力，也影響藥物治療的依從性[5]。目前，關(guān)于檳榔堿對(duì)精子運(yùn)動(dòng)能力各參數(shù)的影響主要集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，而檳榔堿直接對(duì)人精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響報(bào)道較少。

文獻(xiàn)報(bào)道檳榔嚼塊和檳榔堿存在致癌的副作用[6]，印度學(xué)者M(jìn)ukhefiee-A等曾報(bào)道檳榔對(duì)雄性小鼠生殖細(xì)胞有負(fù)面影響。胡怡秀等[7，8]采用小鼠交配實(shí)驗(yàn)觀察檳榔提取液對(duì)雄性小鼠生育力的影響，發(fā)現(xiàn)雌鼠的受孕率呈現(xiàn)出隨劑量增加而下降的劑量反應(yīng)關(guān)系，各實(shí)驗(yàn)組仔鼠出生時(shí)體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組，表明檳榔對(duì)雄性小鼠生育能力及仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育可能存在一定影響；采用精子計(jì)數(shù)、精子活動(dòng)率、精子形態(tài)學(xué)指標(biāo)觀察了檳榔水提取液對(duì)雄性小鼠精子的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檳榔能使小鼠精子數(shù)量顯著減少、精子活動(dòng)率顯著降低、精子畸形率顯著升高；采用小鼠交配實(shí)驗(yàn)，觀察了檳榔對(duì)小鼠撲捉潛伏期、交配潛伏期、平均撲捉次數(shù)、平均交配次數(shù)、撲捉動(dòng)物數(shù)和交配動(dòng)物數(shù)的影響，結(jié)果表明檳榔可導(dǎo)致小鼠性功能顯著減低。

精子本身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和物質(zhì)基礎(chǔ)決定了精子具有活躍運(yùn)動(dòng)的生物學(xué)特征，這也是正常生理狀態(tài)下完成受精過(guò)程的基礎(chǔ)。各種因素造成的精子功能障礙和結(jié)構(gòu)異?？梢酝ㄟ^(guò)精子的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)出來(lái)，而CASA系統(tǒng)可以客觀、精確、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)多種因素對(duì)精子運(yùn)動(dòng)的影響。常用的精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)包括：Mot，是表示前向運(yùn)動(dòng)精子與精子總數(shù)的比值；a級(jí)向前運(yùn)動(dòng)精子百分率，即快速前向運(yùn)動(dòng)（即37℃時(shí)速度≥25 μm·s-1，或20℃速度≥20 μm·s-1）精子占精子總數(shù)的比值；b級(jí)前向運(yùn)動(dòng)精子百分率，即慢速或呆滯的前向運(yùn)動(dòng)精子占精子總數(shù)的比值；VSL，是指精子從運(yùn)動(dòng)的起始點(diǎn)到終點(diǎn)的位移與所需時(shí)間的比值；VCL，是指精子從運(yùn)動(dòng)的起始點(diǎn)到終點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)軌跡路程與時(shí)間的比值。已有研究表明，精子的VCL、VSL等運(yùn)動(dòng)參數(shù)與受精率呈顯著相關(guān)關(guān)系。因此，精子的運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)是綜合反映精子質(zhì)量最直觀、敏感的指標(biāo)。

本研究應(yīng)用CASA系統(tǒng)，觀察了不同濃度檳榔堿溶液對(duì)正常男性精子體外運(yùn)動(dòng)能力的影響，結(jié)果顯示隨著檳榔堿濃度的增高和時(shí)間的延長(zhǎng)，正常男性體外精子運(yùn)動(dòng)能力顯著降低。本課題組已有研究表明，50、100 μg·mL-1等較高濃度檳榔堿溶液在作用一定時(shí)間后，Mot、（a+b）PM、VCL、VSL等精子運(yùn)動(dòng)各參數(shù)均有顯著降低。本研究進(jìn)一步證明檳榔堿具有生殖毒性作用，為檳榔堿具有雄性生殖毒性提供了直接證據(jù)。此結(jié)果還提示，隨著檳榔堿濃度和作用時(shí)間的增加，其對(duì)精子的毒性作用越來(lái)越強(qiáng)。

本研究方法具有耗時(shí)短、影響因素易于控制等特點(diǎn)，但是本試驗(yàn)未能闡述檳榔堿對(duì)正常男性精子體外運(yùn)動(dòng)能力影響的作用機(jī)制，也未能闡述食用檳榔是否對(duì)男性生殖功能有直接影響，這些還有待于進(jìn)一步研究。

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