孫祥德，董 麗，席榮英

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，新鄉(xiāng)市 453003）

琥珀酸亞鐵片是補(bǔ)鐵的常用制劑，其主要成分為琥珀酸亞鐵。目前，該制劑尚未被《中國(guó)藥典》收載，地方標(biāo)準(zhǔn)是用氧化還原滴定法（硫酸鈰法）測(cè)定含量。文獻(xiàn)報(bào)道[1～5]不少其它的補(bǔ)鐵制劑常用分光光度法，但尚未見(jiàn)分光光度法和高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定琥珀酸亞鐵片含量的報(bào)道。容量分析、光譜分析和色譜分析是藥物制劑最主要的含量測(cè)定方法，雖然滴定分析法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度較高，但與光譜法和色譜法相比，其專(zhuān)屬性較差，測(cè)定結(jié)果易受制劑中附加劑的干擾。為此，本文建立了分光光度法和HPLC法測(cè)定琥珀酸亞鐵片含量的2種新方法，并將2種方法的測(cè)定結(jié)果與硫酸鈰法進(jìn)行比較分析，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供更全面、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法。

1 材料

1.1 儀器

LC-6AD HPLC儀、SPD-20A紫外檢測(cè)器（日本Shimadzu公司）；XK96-A快速混合器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）；pHS-3C精密pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；T6紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）。

1.2 試藥

磷酸二氫鉀、磷酸、硫酸亞鐵銨、硫酸鈰、醋酸銨、醋酸、鄰二氮菲、乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA）均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；琥珀酸?duì)照品（系用國(guó)產(chǎn)分析純琥珀酸試劑在乙醇中重結(jié)晶提純制得，純度：＞99.8%）；琥珀酸亞鐵片（金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠，批號(hào)：070302、070310、070512，規(guī)格：每片0.1 g，含量：含鐵（Fe2+）34.0%～36.0%）；試驗(yàn)用水為自制二次蒸餾水。

1.3 試液制備

0.1 mol·L－1硫酸鈰標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取硫酸鈰約42 g，加入含有28 mL硫酸的水500 mL，加熱溶解后，放冷，加水適量使成1000 mL，搖勻。用基準(zhǔn)三氧化二砷標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。

鄰二氮菲指示液：取硫酸亞鐵0.5 g，加水100 mL使溶解，加2滴硫酸與0.5 g鄰二氮菲，搖勻即得。本液應(yīng)在使用時(shí)新鮮制備。

Fe2+對(duì)照品溶液：稱取硫酸亞鐵銨0.1486 g，置于250 mL棕色容量瓶中，加水溶解后，加鹽酸（1→2）0.30 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。臨用前，準(zhǔn)確量取貯備液2.50 mL置于50 mL棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL相當(dāng)于0.004244 mg的Fe2+）。

鄰二氮菲溶液（1.2 g·L－1）：取鄰二氮菲60 mg，加50 mL水溶解，即得。

pH 4.20緩沖液：稱取乙酸銨125 g溶解于約75 mL蒸餾水中，用冰乙酸調(diào)pH值為4.20，再用水稀釋至500 mL，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 硫酸鈰法

取本品20片，除去薄膜衣后精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于琥珀酸亞鐵0.5 g），加稀硫酸20 mL和水30 mL的混合液，振搖使琥珀酸亞鐵溶解后，加鄰二氮菲指示液2滴，立即用硫酸鈰滴定液滴定，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1 mL硫酸鈰滴定液（0.1 mol·L－1）相當(dāng)于5.585 mg的Fe2+。

2.2 分光光度法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。移取Fe2+對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mL置于一系列50 mL容量瓶中，各加入鄰二氮菲溶液2 mL，緩沖液10 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。5 min后，在分光光度計(jì)510 nm波長(zhǎng)處，以試劑空白作參比，測(cè)定吸光度。以濃度（C）對(duì)吸光度（A）作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為C＝5.4142A－0.00266（r＝0.9998），F(xiàn)e2+的檢測(cè)濃度線性范圍為0.04244～2.546 mg·L－1。

2.2.2 精密度試驗(yàn)。制備2.546、0.8488、0.04244 mg·L－13個(gè)濃度的對(duì)照品溶液，各溶液于同日內(nèi)重復(fù)測(cè)定吸光度5次，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算Fe2+濃度及日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)RSD均小于1.0%，日間RSD均小于1.90%。

2.2.3 方法回收率試驗(yàn)。取“2.2.4”項(xiàng)下供試品溶液，準(zhǔn)確加入適量的Fe2+對(duì)照品溶液，測(cè)定Fe2+，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為99.5%。

2.2.4 Fe2+含量測(cè)定。取本品20片，除去薄膜衣后精密稱定，研細(xì)，精密稱取約半片質(zhì)量的樣品粉末置于50 mL容量瓶中，加水適量，超聲溶解20 min，過(guò)濾。準(zhǔn)確量取續(xù)濾液2.0 mL至50 mL容量瓶中加水至刻度，得供試品溶液。取供試品溶液10.00 mL于50 mL容量瓶中，加入3%EDTA溶液5 mL，鄰二氮菲溶液2 mL，緩沖溶液10 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。5 min后，在分光光度計(jì)510 nm波長(zhǎng)處，以試劑空白作參比，測(cè)定吸光度。供試品、對(duì)照品及不含琥珀酸亞鐵的空白輔料溶液的吸收光譜曲線見(jiàn)圖1。

圖1 紫外吸收光譜1.對(duì)照品；2.供試品；3.空白輔料Fig 1 UV absorption spectrum1.reference；2.sample；3.blank excipients

2.3 HPLC法

2.3.1 色譜條件。色譜柱：大連依利特Sinochrom ODS-BP（200 mm×4.6 mm，5 μm）；預(yù)柱：C18（25 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：0.05 mol·L－1KH2PO4（pH＝2.50）；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密稱定琥珀酸對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解，制備成濃度為32.2 mmol·L－1的琥珀酸對(duì)照品溶液，用流動(dòng)相依次等體積稀釋?zhuān)玫揭幌盗袧舛炔坏鹊膶?duì)照溶液。分別取上述系列對(duì)照液20μL進(jìn)樣。以濃度（C）對(duì)相應(yīng)的峰面積（A）作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為C＝1.5145×10－5A+0.1706（r＝0.9990），琥珀酸檢測(cè)濃度線性范圍為0.25～32.2 mmol·L－1。

2.3.3 精密度試驗(yàn)。制備32.2、4.00、0.25 mmol·L－13 個(gè)濃度的對(duì)照品溶液，各溶液同日內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)RSD均小于1.5%，日間RSD均小于2.1%。

2.3.4 方法回收率試驗(yàn)。取“2.3.5”項(xiàng)下供試品溶液，準(zhǔn)確加入適量的琥珀酸對(duì)照品溶液，測(cè)定加樣回收率，結(jié)果平均回收率為99.8%。

2.3.5 樣品含量測(cè)定。取本品20片，除去薄膜衣后精密稱定，研細(xì)，精密稱取約2片質(zhì)量的樣品粉末于100 mL容量瓶中，加適量流動(dòng)相，超聲20 min，用流動(dòng)相稀釋至刻度，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，得供試品溶液，進(jìn)樣20μL。將測(cè)定的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算。

在上述色譜條件下得到的琥珀酸對(duì)照品溶液和供試品溶液的色譜見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；1.琥珀酸Fig 2 HPLC chromatogramsA.reference；B.sample；1.succinic acid

2.4 3種方法含量測(cè)定結(jié)果

3種方法測(cè)定每片琥珀酸亞鐵片中Fe2+含量的結(jié)果見(jiàn)表1。

將本文建立的分光光度法測(cè)定結(jié)果與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法硫酸鈰法測(cè)定結(jié)果在95%置信水平上進(jìn)行F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，結(jié)果表明2種方法的精密度和測(cè)定結(jié)果之間均無(wú)顯著性差異。

3 討論

鄰二氮菲光度法是測(cè)定Fe2+濃度的常用方法，已有很多文獻(xiàn)[1～5]報(bào)道以其測(cè)定不同類(lèi)型樣品中的Fe2+含量。其測(cè)定原理是在適宜的pH值條件下，F(xiàn)e2+與鄰二氮菲生成1∶3橙紅色的穩(wěn)定配合物，該配合物在510 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化顯色劑用量、顯色時(shí)間、顯色溶液pH值等條件，建立了鄰二氮菲光度法測(cè)定琥珀酸亞鐵片中Fe2+含量的測(cè)定方法。亞鐵鄰二氮菲配合物在較廣泛的pH值范圍內(nèi)（pH2～9）都能穩(wěn)定存在，但由于Fe2+在堿性介質(zhì)中易被空氣中的氧氧化為Fe3+，再者Fe2+在堿性較強(qiáng)的溶液中與OH－之間具有較強(qiáng)的配位副反應(yīng)，而在微酸性介質(zhì)中較為穩(wěn)定，因此本試驗(yàn)選擇在酸性介質(zhì)中進(jìn)行顯色。結(jié)果表明，顯色反應(yīng)在pH 4.20的緩沖溶液中顯色完全，配合物穩(wěn)定性好。在上述顯色條件下，配合物溶液的吸光度在顯色5 min時(shí)達(dá)到最大且穩(wěn)定。在測(cè)定Fe2+含量時(shí)，選用EDTA為掩蔽劑，可以有效地掩蔽Fe3+和其它高價(jià)金屬離子對(duì)Fe2+測(cè)定的干擾。

表1 3種方法測(cè)定琥珀酸亞鐵片中Fe2+含量的結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of content determination of three kinds of methods（n＝3）

HPLC測(cè)定的原理是基于琥珀酸中的羧基在215 nm波長(zhǎng)處有紫外吸收而能被檢測(cè)。琥珀酸亞鐵中琥珀酸根離子與Fe2+的摩爾比為1∶1，通過(guò)測(cè)定琥珀酸根離子的量即可計(jì)算Fe2+的含量。固定甲醇比例調(diào)整不同pH值0.05 mol·L－1KH2PO4溶液，以及固定0.05 mol·L－1KH2PO4溶液pH值調(diào)整甲醇比例，從而選擇合適的流動(dòng)相。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相中緩沖液的pH值大于2.80時(shí)，或者含有一定比例的甲醇時(shí)，琥珀酸都會(huì)出現(xiàn)多峰，或搭肩峰、峰前延、拖尾峰等，這可能是因?yàn)殓晁釣槎?，在溶液中因解離而以多種型體存在，各種存在型體的比例決定于溶液的pH值，因此，控制溶液的pH值以抑制其解離，是得到良好色譜峰的重要條件。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)使用0.05 mol·L－1KH2PO4（pH＝2.5）溶液為流動(dòng)相時(shí)，琥珀酸不僅以單峰出現(xiàn)，而且峰形良好。

琥珀酸亞鐵片是一種含鐵（Fe2+）34.0%～36.0%的無(wú)水堿式鹽，其主要活性成分為琥珀酸亞鐵。比較3種方法的測(cè)定結(jié)果可知，本文建立的鄰二氮菲光度法的測(cè)定結(jié)果，與硫酸鈰法的測(cè)定結(jié)果一致。2種方法測(cè)定琥珀酸亞鐵片中亞鐵含量的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異，說(shuō)明2種方法均可用于該片劑的質(zhì)量控制，但以光譜法的專(zhuān)屬性較好，操作簡(jiǎn)便快速。因此，本文建立的鄰二氮菲光度法可以替代現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的硫酸鈰法，用于琥珀酸亞鐵片的含量測(cè)定。

HPLC法的測(cè)定結(jié)果明顯小于其他2種方法（大約為其80%），這是因?yàn)殓晁醽嗚F片是一種含鐵（Fe2+）的無(wú)水堿式鹽，無(wú)確定的結(jié)構(gòu)式和分子式，除了琥珀酸亞鐵外，亞鐵還有其他的存在形式，而HPLC是通過(guò)測(cè)定琥珀酸根離子來(lái)測(cè)定Fe2+的，所以，該法測(cè)定結(jié)果小于其他2種方法。因此，HPLC方法只能測(cè)定與琥珀酸根結(jié)合的亞鐵，不能用于測(cè)定總的亞鐵含量。琥珀酸亞鐵為有機(jī)鐵劑，具有不損傷胃黏膜、胃腸道反應(yīng)較輕的特點(diǎn)[6]。本品在胃酸中解離出的琥珀酸能參與三羧酸循環(huán)和血紅蛋白合成，而且可以促進(jìn)亞鐵離子的吸收[7]，是各種亞鐵鹽中吸收率較好者[8～10]。由此可見(jiàn)，琥珀酸亞鐵是該制劑的主要的有效成分，利用HPLC測(cè)定其有效成分，對(duì)控制琥珀酸亞鐵的生產(chǎn)工藝，確保其主要成分的含量，有著一定的應(yīng)用價(jià)值。

總之，在本文所建立的2種新方法中，鄰二氮菲光度法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可以替代硫酸鈰法用于琥珀酸亞鐵片的含量測(cè)定；而HPLC法雖不能測(cè)定總的亞鐵含量，但可以測(cè)定其有效成分琥珀酸亞鐵的含量，對(duì)優(yōu)化生產(chǎn)工藝和全面控制本制劑質(zhì)量具有一定的意義。

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