糖尿病足是指糖尿病患者由于合并神經(jīng)病變和各種不同程度末梢血管病變而導(dǎo)致下肢感染、潰瘍和(或)深部組織破壞，屬于糖尿病常見嚴(yán)重慢性并發(fā)癥，也是糖尿病患者致殘主要原因之一。通過對(duì)糖尿病足截肢標(biāo)本的分子生物學(xué)研究，進(jìn)一步探討糖尿病足的發(fā)病機(jī)制，論述其與中醫(yī)辨證分型的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

100例糖尿病足截肢標(biāo)本均來自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院2005年8月至2007年7月住院患者。截肢患者中男61例，女39例，年齡54～88歲，平均68.3歲。截肢患者糖尿病病程最短8年, 最長(zhǎng)31年, 平均(18±3.7)年。

1.1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 糖尿病足的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)第2屆糖尿病足會(huì)議所制定的 “糖尿病足(肢端壞疽)檢查方法及診斷標(biāo)準(zhǔn)”。

1.1.2 截肢標(biāo)準(zhǔn) 參照國際糖尿病足工作組編寫的《糖尿病足國際共識(shí)》中關(guān)于“大截肢的定義、標(biāo)準(zhǔn)和指標(biāo)”執(zhí)行。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 有嚴(yán)重的手術(shù)禁忌證、動(dòng)脈硬化閉塞癥、急性動(dòng)脈栓塞、雷諾病等其它肢體缺血性疾病。

1.1.4 中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn) 參照《中醫(yī)外科學(xué)(第7版)》及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則·脫疽》之中醫(yī)辨證分型方案分為氣血兩虛瘀阻、氣陰兩虛瘀阻、脈絡(luò)熱毒型3種證型。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的留取 采取多層面留取，即按小腿上部、內(nèi)踝、足背3個(gè)部位分別留取。標(biāo)本經(jīng)過10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，備用。

1.2.2 設(shè)備與試劑 α-肌動(dòng)蛋白(α-actin)鼠抗人單克隆抗體(天津市津脈基因測(cè)繪技術(shù)有限公司提供)；SP-9000免疫組化染色試劑盒；ZLI-9031濃縮型DAB試劑盒(均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法 標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋, 4μm連續(xù)切片,采用SP法進(jìn)行免疫組化染色,染色過程嚴(yán)格按試劑盒染色程序進(jìn)行，選取已知的陽性切片作陽性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。其中一抗?jié)舛葹?∶200。

1.2.4 圖像分析 采用圖像分析軟件(Image-Pro Plus Analysis software)測(cè)量，在400倍光鏡下，每張切片隨機(jī)取4個(gè)視野，測(cè)量平均光密度(MOD)，即400倍單位視野面積的平均光密度，其值與蛋白表達(dá)呈正比。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以表示，應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用方差分析。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

α-actin在糖尿病足的不同辨證分型的神經(jīng)組織以及動(dòng)脈組織中表達(dá)均呈陽性，見圖1、圖2(彩圖見封3)。并且陽性的表達(dá)與證型之間有高度的相關(guān)性。在神經(jīng)組織以及動(dòng)脈組織中均是脈絡(luò)熱毒證表達(dá)最強(qiáng)，氣血兩虛瘀阻證表達(dá)最弱。在神經(jīng)組織中：三證型間比較有顯著性差異，三證型中各部位比較均無顯著性差異。在動(dòng)脈組織中：脈絡(luò)熱毒證與氣陰兩虛瘀阻證、氣陰兩虛瘀阻證與氣血兩虛瘀阻證、氣血兩虛瘀阻證與脈絡(luò)熱毒證比較均差異顯著。三證型內(nèi)部各部位比較除脈絡(luò)熱毒證中腓腸肌中點(diǎn)與足底部動(dòng)脈比較差異有顯著性，其余差異均無顯著性。見表1～4。

圖1 ×400 α-actin在動(dòng)脈中的陽性表達(dá)

圖2 ×400 α-actin在神經(jīng)中的陽性表達(dá)

中醫(yī)證型nMOD脈絡(luò)熱毒320.107±0.015氣陰兩虛瘀阻330.089±0.005氣血兩虛瘀阻350.081±0.017

注：三證型間比較，χ2=33.04，差異有顯著性(P<0.05)。

表2 各證型不同部位神經(jīng)組織中α-actin的表達(dá)

表3 各證型動(dòng)脈中α-actin的表達(dá)

注：與脈絡(luò)熱毒比較，aP<0.05；與氣陰兩虛瘀阻比較，bP<0.05。

表4 各證型不同部位動(dòng)脈中α-actin的表達(dá)

注：脈絡(luò)熱毒中腓腸肌中點(diǎn)與足底比較,aP<0.05。

3 討論

糖尿病肢端壞疽是一種慢性、進(jìn)行性，涉及大、中、小及微血管的疾患，主要是代謝紊亂、肢端缺血、神經(jīng)病變、感染等多種誘因所致。糖尿病足的病變組織首先涉及血管及神經(jīng)，血管及神經(jīng)的病變不斷發(fā)展，進(jìn)而引起肌肉的病變，糖尿病足的損傷首先表現(xiàn)在神經(jīng)、血管及肌肉等組織上，進(jìn)而影響器官乃至整個(gè)系統(tǒng)，因此我們從血管、神經(jīng)這些組織入手，利用分子生物學(xué)研究這些組織微觀上的變化，進(jìn)而研究糖尿病足的發(fā)病機(jī)制，探討其與中醫(yī)辨證分型的聯(lián)系及相關(guān)性。

肌動(dòng)蛋白纖維參與構(gòu)成微絲與細(xì)肌絲，是肌細(xì)胞和非肌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)成分[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞的骨架有三種結(jié)構(gòu)：微絲、微管和中間絲，以微絲在維持內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和完整性中所起作用最重要。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)在成年個(gè)體是一種高度特化的細(xì)胞，具有收縮、調(diào)節(jié)血管張力和維持血壓等功能。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle-actin，α-SM-actin)是細(xì)胞來源于平滑肌組織的標(biāo)志，在不同表型的平滑肌細(xì)胞中具有不同的表達(dá)比例。根據(jù)其表達(dá)比例的不同，主要被分為兩種表型：收縮型、增殖型。成熟的VSMC處于較低的增殖速率，以收縮表型為主；在刺激因素如血清血小板衍化生長(zhǎng)因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)等血漿反應(yīng)因子(Serum response factor，SRF)作用下或血管內(nèi)膜損傷，VSMC表型發(fā)生改變，以合成表型為主，促使VSMC增殖、遷移，并產(chǎn)生多種胞外基質(zhì)如膠原、彈力蛋白、蛋白聚糖等，在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展中起重要作用。α-SM-actin是平滑肌細(xì)胞分化成熟的最主要的細(xì)胞骨架蛋白，許多研究認(rèn)為α-SM-actin是表現(xiàn)VSMC收縮表型的重要標(biāo)記物。細(xì)胞內(nèi)α-SM-actin含量的改變與細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變是一致的，其表達(dá)減少標(biāo)志著細(xì)胞由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化[2-3]。本試驗(yàn)也證實(shí)了隨著病情的不斷加重，VSMC由收縮性轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，促使VSMC增殖，遷移，使中膜平滑肌細(xì)胞增殖明顯，以致管腔狹窄。加重缺血，使局部營養(yǎng)障礙，癥狀加重。

在神經(jīng)元發(fā)育過程中，神經(jīng)突起沿特定的路線生長(zhǎng)、延長(zhǎng)，并伸向?qū)⑴c它建立突觸聯(lián)系的靶細(xì)胞、神經(jīng)元的胞體、樹突或軸突。而在神經(jīng)突起伸長(zhǎng)及向特定的方向生長(zhǎng)方面，生長(zhǎng)錐(growth cone)起決定作用。生長(zhǎng)錐是個(gè)活躍運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)，其與神經(jīng)突起的生長(zhǎng)、軸突的特殊途徑的選擇、靶細(xì)胞的識(shí)別和突觸的形成有關(guān)。神經(jīng)突起的生長(zhǎng)、伸長(zhǎng)只發(fā)生在生長(zhǎng)錐。肌動(dòng)蛋白在生長(zhǎng)錐的可動(dòng)性中可能起關(guān)鍵作用[4-5]。生長(zhǎng)錐的板足及絲足的活躍運(yùn)動(dòng)有賴于肌動(dòng)蛋白有序、快速的聚合和解聚。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，正是由于細(xì)胞骨架的參與，軸突才能循著正確的路徑長(zhǎng)至相應(yīng)的靶細(xì)胞。糖尿病足的發(fā)展過程中，隨著病變的發(fā)展，血管結(jié)構(gòu)和功能逐漸破壞，進(jìn)而影響到神經(jīng)，肌動(dòng)蛋白生成減少，生長(zhǎng)椎的可動(dòng)性降低，抑制了神經(jīng)突起的生長(zhǎng)，從而引起一系列的神經(jīng)癥狀，隨著病程的不斷增長(zhǎng)，病情的不斷加重，神經(jīng)方面的癥狀也隨之越來越嚴(yán)重。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出證型不同，細(xì)胞損傷也相應(yīng)的有差別，特別在氣陰兩虛瘀阻證和脈絡(luò)熱毒證中表現(xiàn)尤為突出。氣血兩虛瘀阻證表達(dá)最低說明細(xì)胞受損嚴(yán)重，所以臨床中治療糖尿病足常用益氣養(yǎng)陰、清熱利濕、活血化瘀藥物以減輕癥狀，此研究結(jié)果為此法的廣泛應(yīng)用提供了客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)臨床具有重要的指導(dǎo)意義。通過本實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了糖尿病足的中醫(yī)辨證分型與病理學(xué)之間有相關(guān)性，同時(shí)也表明了α-actin在糖尿病足的動(dòng)脈、神經(jīng)中的作用和損傷機(jī)理及其與病情的關(guān)系，對(duì)這一問題的深入研究，可能為臨床防治糖尿病足提供新的思路，研究出作用于血管、神經(jīng)中肌動(dòng)蛋白的藥物，從而抑制血管、神經(jīng)病變的發(fā)展，達(dá)到預(yù)防和控制糖尿病足的療效。

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