于 峰,王思明,董 玫,倪志宇,董富潔,史清文*,鈴木信夫,叢 斌

1河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石家莊 050017;2河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,石家莊 050017;3千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部環(huán)境影響生物化學(xué)教室,千葉市

菊科是有花植物中最大的科,含有 1100多個(gè)屬,23000～25000多種植物,很多菊科植物在各國(guó)民間藥用。土木香(Inula helenium)系菊科旋覆花屬植物,為多年生草本,其根供藥用,具有健胃、利尿、祛痰和驅(qū)蟲等功效[1]。性溫,味辛、苦。在我國(guó)分布于新疆,其它許多地區(qū)常栽培。藥理活性研究發(fā)現(xiàn)土木香內(nèi)酯類成分有抗腫瘤細(xì)胞增殖作用和抗結(jié)核分支桿菌等作用[2,3]。旋覆花(Inula japonica)為菊科旋覆花屬植物,是多年生直立草本植物,主要分布于我國(guó)的東北、華北、西北及浙江、江蘇、四川和廣東等地區(qū)[1]。近年研究表明旋覆花的主要成分為倍半萜內(nèi)酯類化合物,藥理活性方面有細(xì)胞毒性和抗微生物等報(bào)道[4,5]。本文對(duì)從土木香的根中和旋覆花得花中分離得到的三種主要倍半萜內(nèi)酯化合物異土木香內(nèi)酯(1)[6],1-氧-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯(2)[7]和大花旋覆花內(nèi)酯(3)[7]進(jìn)行了體外抗腫瘤細(xì)胞增殖活性的實(shí)驗(yàn),初步探討了這三種化合物結(jié)構(gòu)與活性之間的構(gòu)效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

三種倍半萜類化合物:異土木香內(nèi)酯(1),1-氧-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯(2)和大花旋覆花內(nèi)酯(3)由史清文教授分別從菊科旋覆花屬土木香(Inula helenium)的根中和旋覆花(Inula japonica)的花中分離得到,均為白色針晶,經(jīng)核磁共振光譜和質(zhì)譜確定它們的結(jié)構(gòu)如下(1～3),純度 99%。

1.2 藥品和試劑

噻唑藍(lán)(MTT,Sigma,M-2128);RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO);胰蛋白酶(GIBCO);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);順鉑(Sigma,034k3693)。

1.3 細(xì)胞系和培養(yǎng)條件

試驗(yàn)用腫瘤細(xì)胞株由日本千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二生物化學(xué)教室提供。U251SP:人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株[8];HLE:人肝癌細(xì)胞株[8];MM1-CB:人黑色素瘤細(xì)胞株[8];KT:人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞株[8]。試驗(yàn)用正常細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。HELF:正常人胚肺成纖維細(xì)胞。各腫瘤細(xì)胞株接種于直徑為 100mm的培養(yǎng)皿中,加入含 10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基,37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 方法

參照文獻(xiàn)[9]中的方法。將被試細(xì)胞懸浮接種于 96孔板,每孔 90μL(含 1×104個(gè)細(xì)胞),分別加入磷酸鹽緩沖液(PBS)、溶劑對(duì)照(終濃度 0.5%DMSO)、陽(yáng)性對(duì)照順鉑和終濃度為 100、10和 1 μmol/L的化合物 1～3各 10μL,每組均設(shè) 3復(fù)孔,置于飽和濕度、37℃和 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h。于培養(yǎng)結(jié)束前 4 h,各培養(yǎng)孔加入 5mg/mL四氮唑鹽 (MTT)10μL,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度值(OD值),測(cè)定波長(zhǎng) λ=570 nm,參考波長(zhǎng) λ=630 nm,并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率,細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-OD對(duì)照組/OD實(shí)驗(yàn)組)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用 x±s表示;兩組間數(shù)據(jù)用 t-檢驗(yàn),多組間數(shù)據(jù)用單因素方差分析。應(yīng)用 SAS612統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 化合物 1～3對(duì)體外培養(yǎng)的 U251SP細(xì)胞增殖的抑制作用

結(jié)果如圖 1所示,陽(yáng)性對(duì)照順鉑顯示較強(qiáng)的抑制人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251SP)增殖活性的作用,1、10和 100μmol/L順鉑處理 U251SP細(xì)胞后,腫瘤細(xì)胞抑制率分別為 24.62、47.71和 69.99;化合物 1用相同的劑量處理 U251SP細(xì)胞后,其腫瘤細(xì)胞增殖抑制率與順鉑幾乎相同,分別為 21.48、54.56和72.20,并且與空白對(duì)照組相比較極顯著性差異,提示化合物 1有較強(qiáng)的抑制 U251SP細(xì)胞增殖的作用。通過(guò)腫瘤細(xì)胞增殖抑制率對(duì)順鉑和化合物 1濃度的對(duì)數(shù)回歸方程 y=9.8521lnx+24.755和 y=11.014lnx+24.053,得到順鉑和化合物 1對(duì)U251SP細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為12.97和 10.55μmol/L?；衔?2和 3對(duì) U251SP細(xì)胞的增殖不顯示抑制活性。

圖 1 三種倍半萜內(nèi)酯化合物對(duì)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of three compounds on the proliferation of U251SP tumor cell line

2.2 化合物 1～3對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用

結(jié)果如圖 2所示,陽(yáng)性對(duì)照順鉑對(duì)人肝癌細(xì)胞(HLE)增殖幾乎不顯示抑制活性,即使用 100 μmol/L順鉑處理 HLE細(xì)胞,其腫瘤細(xì)胞抑制率僅為 14.01%,而用 1、10和 100μmol/L的化合物 1處理 HLE細(xì)胞后,其腫瘤細(xì)胞抑制率分別為 21.42、36.56和 64.13,與空白對(duì)照組相比較極顯著性差異,并且呈現(xiàn)較好的劑量以來(lái)關(guān)系,提示化合物 1有較強(qiáng)的抑制 HLE細(xì)胞增殖的作用?；衔?2只在100μmol/L劑量組顯示較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性,其腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率為 55.67,而化合物3對(duì) HLE細(xì)胞的增殖不顯示抑制活性。

圖 2 三種倍半萜內(nèi)酯化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of three compounds on the proliferation of HLE tumor cell line

2.3 化合物 1～3對(duì)體外培養(yǎng)的人黑色素瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

結(jié)果如圖 3所示,陽(yáng)性對(duì)照順鉑對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞(MM 1-CB)增殖幾乎不顯示抑制活性,即使用100μmol/L順鉑處理 MM 1-CB細(xì)胞,其腫瘤細(xì)胞抑制率僅為 8.98%,而用 1、10和 100μmol/L的化合物 1處理 MM1-CB細(xì)胞,其腫瘤細(xì)胞增殖抑制率分別為 13.77、61.44和 87.03,與空白對(duì)照組相比較極顯著性差異,并且呈現(xiàn)較好的劑量以來(lái)關(guān)系,提示化合物 1有較強(qiáng)的抑制 MM1-CB細(xì)胞增殖的作用?；衔?2只在 100μmol/L劑量組顯示中等程度的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性,其腫瘤細(xì)胞增殖抑制率為39.13,而化合物 3對(duì) MM1-CB細(xì)胞的增殖不顯示抑制活性。

圖 3 三種倍半萜內(nèi)酯化合物對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effectof three compounds on the proliferation of MM 1-CB tumor cell line

2.4 化合物 1～3對(duì)人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的影響

陽(yáng)性對(duì)照順鉑對(duì)人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞(KT)的增殖顯示較強(qiáng)的抑制活性,IC50僅為 6.26 μmol/L,而化合物 1對(duì) KT細(xì)胞的增殖顯示中等程度的抑制活性,IC50為 48.52μmol/L,化合物 2和 3對(duì) KT細(xì)胞增殖不顯示抑制活性,IC50均大于 100 μmol/L。

2.5 化合物 1～3對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖抑制活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 4所示,陽(yáng)性對(duì)照順鉑對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)的增殖呈現(xiàn)較強(qiáng)的抑制活性,IC50為 16.89μmol/L,化合物 1僅在 100μmol/L劑量組顯示較低的細(xì)胞增殖抑制活性,其細(xì)胞增殖抑制率為 22.54,其它兩種試驗(yàn)用化合物對(duì) HELF細(xì)胞的增殖不顯示抑制活性,三種被試化合物的 IC50均大于 100μmol/L。

圖 4 三種倍半萜內(nèi)酯化合物對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of three compounds on the proliferation of Human embryonic lung fibroblast

3 討論

癌癥是威脅人類健康的一大兇手,是僅次于心腦血管疾病的第二大致死性疾病(如果將心血管疾病和腦血管疾病分開統(tǒng)計(jì),癌癥則位于第一位),嚴(yán)重地威脅人類的健康和生命?，F(xiàn)在臨床上應(yīng)用的抗癌藥物雖然種類不少,但價(jià)格昂貴,毒副作用嚴(yán)重,且尚沒(méi)有治療某些癌癥的特效藥。因此尋找療效確切,作用機(jī)理清楚,治愈率高,毒副作用小的抗癌藥物,攻克癌癥成為全世界醫(yī)藥工作者亟待解決的一大課題。植物在其漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中合成了許許多多結(jié)構(gòu)各異的次生代謝天然產(chǎn)物,這些次生代謝產(chǎn)物不僅具有不同的生物活性,還常常被發(fā)現(xiàn)有新的作用機(jī)制,象紫杉醇(Taxol·)、長(zhǎng)春新堿(Vincristine,VCR)、喜樹堿(Camptothecin,CPT)就是從植物中發(fā)現(xiàn)的三個(gè)優(yōu)秀的天然抗癌藥物中的代表,但彼此具有三個(gè)不同的甚至完全相反的抗癌作用機(jī)制,這些天然藥物的發(fā)現(xiàn)和在臨床上的廣泛應(yīng)用,極大地推動(dòng)了化學(xué)家和藥學(xué)家對(duì)抗癌藥物的研發(fā),并極大地促進(jìn)了病理學(xué)家和生物學(xué)家對(duì)抗癌作用機(jī)理的研究[10,11]。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前使用的化學(xué)藥物中,30%以上是天然化合物經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)生的,而臨床上應(yīng)用的抗癌藥物 74%來(lái)源于天然產(chǎn)物和天然產(chǎn)物的衍生物或是因受天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的啟發(fā)而設(shè)計(jì)的合成藥物。從包括植物在內(nèi)的自然界中尋找發(fā)現(xiàn)高效低毒的抗癌活性成分或先導(dǎo)化合物一直是國(guó)內(nèi)外藥物學(xué)家十分關(guān)注的課題和研究的熱點(diǎn)[12-29]。用中草藥治療癌癥在我國(guó)有著悠久的歷史和豐富的臨床經(jīng)驗(yàn),用現(xiàn)代的方法研究其活性成分及其作用機(jī)制是發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)化合物研制開發(fā)新型抗癌藥物的一條捷徑。

菊科旋覆花屬植物含有豐富的倍半萜內(nèi)酯類化合物,很多倍半萜內(nèi)酯類化合物都顯示有不同程度的抗腫瘤活性。楊超等于 2003年報(bào)道了旋覆花地上部分的倍半萜內(nèi)酯類成分對(duì)腫瘤細(xì)胞 SMMC-7721以及 HO-8910具有細(xì)胞毒作用[4]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,三個(gè)倍半萜內(nèi)酯類化合物中,異土木香內(nèi)酯對(duì)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、人黑色素瘤和人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用,對(duì)于正常的細(xì)胞,即人胚肺成纖維細(xì)胞的增殖不呈現(xiàn)抑制活性,而 1-氧-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯僅在 100μmol/L的高濃度下,對(duì)人肝癌細(xì)胞和人黑色素瘤細(xì)胞的增殖顯示中等程度的抑制活性,大花旋覆花內(nèi)酯對(duì)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、人黑色素瘤和人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的增殖不顯示任何抑制活性。從結(jié)構(gòu)上分析異土木香內(nèi)酯(1)屬于桉葉烷型(Eudesmane)倍半萜內(nèi)酯,A環(huán)和 B環(huán)呈反式聚合,7,8位含有一個(gè) α,β-不飽和的五員內(nèi)酯環(huán)。1-氧-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯(2)和大花旋覆花內(nèi)酯(3)都屬于 1,10-開環(huán)的桉葉烷型(1,10-Seco-eudesmane)倍半萜內(nèi)酯,二者在 5位均有一個(gè)含有 5個(gè)碳原子的側(cè)鏈,由此推測(cè) A環(huán)開環(huán)可能是導(dǎo)致 1-氧-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯(2)和大花旋覆花內(nèi)酯(3)對(duì)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、人黑色素瘤和人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的增殖不顯示抑制活性的原因。

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