韓順平，楊幼新，苑朝升，楊 曼，馬 艷

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)際教育學(xué)院，天津 300193；2.解放軍272醫(yī)院，天津 300020）

大黃藿苓湯對(duì)慢性腎衰大鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響*

韓順平1，楊幼新1，苑朝升2，楊 曼2，馬 艷1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)際教育學(xué)院，天津 300193；2.解放軍272醫(yī)院，天津 300020）

[目的]探討大黃藿苓湯對(duì)慢性腎功能衰竭大鼠腎臟的保護(hù)作用及機(jī)制。 [方法]采用腺嘌呤造模，設(shè)空白組、模型組、治療1、2組。[結(jié)果]治療1、2組腎臟病理改變較模型組輕，尿素氮、肌酐、尿酸、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）表達(dá)治療1組較模型組減少（P<0.05），治療2組與模型組相比bFGF表達(dá)無明顯差異。[結(jié)論]大黃藿苓湯對(duì)腺嘌呤致慢性腎衰大鼠腎臟有保護(hù)作用，且早期用藥優(yōu)于晚期用藥，其機(jī)制可能是抑制bFGF表達(dá)。

大黃藿苓湯；腺嘌呤；慢性腎衰；bFGF

慢性腎功能衰竭（CRF）是由多種慢性腎臟疾病發(fā)展到晚期，腎實(shí)質(zhì)損害引起臨床綜合征。其臨床癥狀復(fù)雜，死亡率較高，透析和腎臟移植是治療該病的重要手段，但治療費(fèi)用較高，尚未普及。因此，CRF的非透析療法為國(guó)內(nèi)外醫(yī)家所重視。大黃藿苓湯是臨床治療CRF的有效方藥。為探討其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察了大黃藿苓湯對(duì)腺嘌呤所致大鼠慢性腎功能衰竭成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量150～180 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所繁育場(chǎng)提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 腺嘌呤（Adenine，C5H5N5，F(xiàn)W：135.13）購于上海伯奧生物科技有限公司，進(jìn)口分裝，批號(hào)：020508。用時(shí)加蒸餾水配成2%混懸液，置4℃冰箱備用，混勻后使用。大黃藿苓湯：由大黃、淫羊藿、豬苓、茯苓、雷公藤、莪術(shù)、丹參、紅花、當(dāng)歸等藥物組成，藥材由解放軍第272醫(yī)院中藥房提供，煎成生藥濃度為7.04kg/L的煎劑裝瓶，置4℃冰箱備用。

1.3 主要試劑 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）試劑盒，采用武漢博士德生物工程公司進(jìn)口分裝試劑盒。使用日立7020全自動(dòng)生化儀、光學(xué)顯微鏡、美國(guó)600CL PISERA彩色圖像分析儀等儀器進(jìn)行檢測(cè)分析。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及造模方法 40只大鼠購入后，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組，即空白組、模型組、治療1組、治療2組，每組各10只。除空白組外，各組按250mg/（kg·d）給大鼠腺嘌呤灌胃[1-2]空白組用等量生理鹽水灌胃，造模用藥21 d，并于第21天經(jīng)眼眶取血做腎功能檢查。

2.2 給藥方法 空白組、模型組：實(shí)驗(yàn)開始至51 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束，1次/d，2mL/只生理鹽水灌胃；治療1組：實(shí)驗(yàn)開始至51 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束，1次/d，大黃藿苓湯2mL/只灌胃；治療2組：實(shí)驗(yàn)開始至21 d，1次/d，2mL/只生理鹽水灌胃，實(shí)驗(yàn)22～51 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束，大黃藿苓湯2mL/只灌胃。治療過程中大鼠自由進(jìn)食、飲水。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 尿素氮、肌酐、尿酸、血鈣、血磷 血標(biāo)本離心，取血清，日立7020型全自動(dòng)生化儀測(cè)定。

2.3.2 腎組織形態(tài)學(xué) 腎臟標(biāo)本10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)蘇木-伊紅（HE）染色，光鏡觀察。

2.3.3 免疫組化染色 石蠟切片脫蠟，3%過氧化氫滅火內(nèi)源性酶，電爐煮沸抗原修復(fù)，5%～10%正常山羊血清封閉，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗、二抗及適當(dāng)比例的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 計(jì)量資料用單因素方差分析，等級(jí)資料使用秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 第21天時(shí)各組生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 見表1。

通過表1可以看到，在第21天時(shí)，模型組尿素氮、肌酐、尿酸均明顯高于空白組（P<0.01），說明造模成功。在造模同時(shí)預(yù)防性治療1組在第21天時(shí)，尿素氮、血肌酐、尿酸的上升水平明顯低于模型組，即腎功能損害明顯輕于模型組，但血鈣、血磷的變化不明顯。

表1 第21天時(shí)各組生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(±s)Tab.1 Resultsof biochem icalparametersofeach group on 21stday(±s)

表1 第21天時(shí)各組生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(±s)Tab.1 Resultsof biochem icalparametersofeach group on 21stday(±s)

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05。

組別空白組模型組治療1組血磷(mmol/L)2.18±0.41 4.64±1.09**4.40±0.53**尿素氮(mmol/L)8.94±0.397 26.48±6.42**23.33±6.06**△肌酐(μmol/L)33.2±3.82 92.3±25.79**76.9±16.18**△尿酸(mmol/L)194.57±44.76 337.67±133.25**309.6±115.99**△血鈣(mmol/L)2.21±0.08 2.10±0.17 2.29±0.14

3.2 第51天時(shí)各組生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 見表2。

表2 第51天時(shí)各組生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(±s)Tab.2 Resultsof biochem icalparametersofeach group on 51stday(±s)

表2 第51天時(shí)各組生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(±s)Tab.2 Resultsof biochem icalparametersofeach group on 51stday(±s)

注：與空白組比較，**P<0.01；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△△P<0.01；與模型組比較，△P<0.05。

組別空白組模型組治療1組治療2組尿素氮(mmol/L)7.42±0.96 15.27±3.62*10.89±1.42△10.79±1.98△肌酐(μmol/L)31.2±6.56 60.6±7.60**34.3±4.69△35.7±6.77△尿酸(mmol/L)111.04±21.12 199.56±24.56**92.73±15.34△△121.29±45.19△血鈣(mmol/L)2.17±0.37 2.22±0.35 2.30±0.27 2.32±0.48血磷(mmol/L)1.92±0.29 4.47±0.30**2.01±0.28△2.07±0.49△

通過表2可以看出，治療1、2組腎功能、血磷指標(biāo)均明顯好于模型組，表明大黃藿苓湯可以明顯抑制腎衰的進(jìn)展，治療1、2組之間無明顯差別，治療1組較治療2組腎功能進(jìn)展有減慢的趨勢(shì)。

3.3 病理學(xué)觀察 空白組：腎組織如常，組織學(xué)均未見著變。模型組：腎體積均明顯增大。個(gè)別動(dòng)物腎體積較正常對(duì)照組可增大1倍以上。各腎均存在區(qū)域性腎單位萎縮、消失，纖維組織增生明顯及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。部分腎小管上皮細(xì)胞壞死、消失或擴(kuò)張，甚者呈囊性。腎實(shí)質(zhì)內(nèi)腎小球數(shù)目明顯減少并可見大小不一、數(shù)量不等的棕褐色結(jié)晶或異物肉芽腫形成及粉染勻質(zhì)的管型。治療1組：腎病變較模型對(duì)照組明顯減輕，腎體積除個(gè)別動(dòng)物外，均略增大或接近正常對(duì)照組，腎單位萎縮、消失，纖維組織增生面積較小且局限在近被膜的皮質(zhì)部分。除個(gè)別動(dòng)物外，擴(kuò)大的腎小管及結(jié)晶體形成均減輕，部分腎組織學(xué)與正常對(duì)照組比較大致相似。治療2組：腎病變較模型對(duì)照組減輕，區(qū)域性腎單位萎縮消失。纖維組織增生面積較模型組小；擴(kuò)大的腎小管及腎實(shí)質(zhì)內(nèi)的結(jié)晶體亦少些。

3.4 免疫組化結(jié)果 測(cè)量方法采用半定量方法進(jìn)行判定，每張切片觀察10個(gè)視野，細(xì)胞核被染成棕褐色定為陽性結(jié)果。半定量方法是根據(jù)每張切片陽性反應(yīng)顆粒的顏色深淺和占細(xì)胞總數(shù)的比例來測(cè)量：陰性（－）：未見或偶見陽性顆粒，顏色成淺黃色：陽性（＋）：陽性顆粒少于1/3，顏色呈淺棕黃色；中等陽性（＋＋）：陽性顆粒介于 1/3～2/3，顏色介于+ ～+++ 間；強(qiáng)陽性（＋＋＋）：陽性顆粒大于 2/3，顏色呈棕褐色。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子免疫組化結(jié)果為：近曲、遠(yuǎn)曲間質(zhì)、血管內(nèi)細(xì)胞及血管內(nèi)皮都有陽性表達(dá)，正常對(duì)照組腎小管及間質(zhì)呈均勻一致的淡黃染，管腔內(nèi)藥物結(jié)晶體呈黃棕褐色表達(dá)。

表3 各組大鼠成纖維細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果Tab.3 The determ ination resultof fibroblast in ratsof each group

4 討論

慢性腎功能衰竭為內(nèi)科危重病癥，是由于多種慢性腎臟疾患發(fā)展到晚期，腎實(shí)質(zhì)損害引起慢性腎功能嚴(yán)重?fù)p害，體內(nèi)氮質(zhì)及其代謝產(chǎn)物潴留，不能維持體內(nèi)水、電解質(zhì)及酸堿平衡而引起的各種臨床綜合征。其機(jī)制目前尚未完全清楚，對(duì)于CRF的治療主要采用保守治療和透析治療、腎移植的替代療法，由于替代療法的治療費(fèi)用昂貴，尚難普及，因此中醫(yī)藥治療CRF有著重要意義。CRF類似中醫(yī)學(xué)的“水腫”、“癃閉”“虛勞”、“關(guān)格”、“溺毒”等癥。根據(jù) CRF發(fā)生發(fā)展病程中主要臨床表現(xiàn)，筆者認(rèn)為CRF的病機(jī)為內(nèi)生和外來之毒侵蝕機(jī)體，引發(fā)臟腑陰陽失調(diào)，血瘀氣滯，精血耗損，故自擬具有活血化瘀、益氣養(yǎng)血、補(bǔ)腎健脾、利水排毒的大黃藿苓湯治療，取得了較好的臨床效果。近年研究發(fā)現(xiàn)，血小板源生長(zhǎng)因子[3-4]參與小管、間質(zhì)的損傷過程，并刺激間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的增多，促進(jìn)腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化和小管周圍毛細(xì)血管喪失的發(fā)生與發(fā)展。血小板源性生成因子（PDGF）體外實(shí)驗(yàn)可使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞較腎臟固有的成纖維細(xì)胞具有更強(qiáng)的纖維化功能，是腎纖維化及其他組織纖維化中細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多的主要原因之一。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子廣泛存在于多種組織中，能夠以自分泌和旁分泌的方式促使系膜細(xì)胞增殖及其產(chǎn)生ECM，對(duì)成纖維細(xì)胞有很強(qiáng)的促分裂與刺激增生、趨化移行的作用。研究表明[3]bFGF可促進(jìn)人腎成纖維細(xì)胞增殖、分泌Ⅰ型膠原增加。本實(shí)驗(yàn)研究表明大黃藿苓湯可減低CRF大鼠尿素氮、血肌酐、尿酸，減少腎組織的腎單位萎縮、消失、纖維組織增生面積，抑制慢性腎功能衰竭成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF的表達(dá)。說明大黃藿苓湯能改善慢性腎功能衰竭的臨床癥狀，延緩病情的惡化，其機(jī)制可能是抑制慢性腎衰成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF的表達(dá)，進(jìn)而抑制腎臟纖維組織化。

[1]周小舟,張盛光，陽 曉，等.腺嘌呤所致CRF大鼠的機(jī)理研究[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,1997，17(1)∶54-54.

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[5]韋 穎，樊均明，潘麗萍，等.堿性成纖維細(xì)胞因子對(duì)人腎成纖維細(xì)胞的影響[J].中華腎病雜志，2002，18（2）：135-136.

Effectsof dahuang huoling decoction on the expression of bFGF in ratswith chronic renal failure

HANShun-ping1,YANGYou-xin1,YUANChao-sheng2,etal
（1.Tianjin University of TCM， Tianjin， China 300193； 2.The PLA 272Hospital， Tianjin 300020， China）

[Objection]To explore the protective function and ofDahuang Huoling decoction on ratswith chronic renal failure.[Methods]To establish the ratsmodelby using adenine,divide themodel rats into normalgroup,modelgroup,medicated group 1 andmedicated group 2.[Results]The pathology changesof themedicated group 1 and 2were lighter than thatof the controlgroup.Blood Urea Nitrogen(BUN),creatinine,uric acid and bFGFexpressionsofmedicated group 1 were lower than thatof themodelgroup(P<0.05).The bFGF expressions inmedicated group 2werenoobviously differentiation than that inmodelgroup(P>0.05).[Conclusion]Dahuang Huoling decoction had protective function on chronic renal failure of rat kidney caused by adenine.Earlymedication wasmore effective than later period.Itsmechanism can be the restraintin bFGFexpressions.

Dahuang Huoling decoction;adenine;CRF;bFGF

R285.5

A

1672-1519(2010)03-0245-03

天津市自然基金項(xiàng)目（003607811）。

韓順平（1965-），男，碩士，助理研究員，主要從事中醫(yī)治療疑難病的臨床和基礎(chǔ)研究工作。

2010-01-10）