南程慧,王賢榮,湯庚國,顧 宇

(南京林業(yè)大學(xué) 森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

迎春櫻(CerasusdiscoideaYü et Li)屬薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)櫻屬(Cerasus)，小喬木或喬木，野外調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)部分單株樹高可達(dá)15 m.傘形花序著花1～3朵；總苞片褐色，倒卵狀橢圓形；苞片綠色，近圓形或扇形,果期宿存；萼筒管形鐘狀，外面被稀疏柔毛，萼片長圓形，平展或反折；花瓣橢圓形，先端兩裂；核果紅色或紫紅色.迎春櫻花色粉紅，先葉開放，為早春優(yōu)質(zhì)的觀花植物.主要分布于我國的安徽、浙江、江西、福建等地，生于山谷林緣或溪邊灌叢中，海拔200～1 100 m處[1,2].

我國野生櫻花資源豐富,但引種開發(fā)利用較少,僅有高盆櫻(Cerasuscerasoides)、鐘花櫻(Cerasuscampanulata)、野生早櫻(Cerasussubhirtellavar.ascendens)等少數(shù)種或變種進(jìn)行過繁殖利用方面的研究[3-10].迎春櫻作為華東低海拔地區(qū)的早春觀花樹種,至今還未有引種繁殖利用方面的研究見諸報(bào)道，作者僅見南京中山植物園、南京梅花山、杭州植物園、武漢植物園及江西農(nóng)業(yè)大學(xué)對其進(jìn)行園林利用，且多屬直接的野外成樹移植.為合理保護(hù)和開發(fā)利用野生迎春櫻資源，豐富華東地區(qū)園林觀賞樹木種類，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了迎春櫻組培無菌外植體獲得方法的初步研究，以期為迎春櫻進(jìn)一步的組培快繁提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2009年5月采于安徽黃山桃花峰的迎春櫻成熟果實(shí)，經(jīng)堆漚軟化后，水洗干凈；果核室溫下于光亮處陰晾一周；裝入密封塑料袋中，置于3℃左右冰箱中低溫冷藏備用.

2010年5～8月于南京中山植物園采集迎春櫻當(dāng)年生半木質(zhì)化嫩枝作為實(shí)驗(yàn)材料.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沙床苗外植體實(shí)驗(yàn) 檢測低溫冷藏10個(gè)月的迎春櫻果核千粒重、生活力等指標(biāo)；隨機(jī)選取迎春櫻帶內(nèi)果皮種子，打破內(nèi)果皮，取出種子作為實(shí)驗(yàn)材料；自來水沖洗30 min后，70%酒精浸泡30s，0.2% HgCl2溶液浸種3 min,無菌水沖洗5～6次后,浸泡30 min,除去殘余HgCl2；用不同濃度的GA(分子式C19H22O6,分子量346.37)溶液浸種6 h后，將處理好的迎春櫻種子置于經(jīng)過120℃高溫消毒過的培養(yǎng)皿沙床中，沙床用對應(yīng)濃度的GA溶液潤濕[11]；在溫度為15℃，光照強(qiáng)度為1 500～2 000lx，黑暗8 h，光照16 h的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，觀測記錄不同時(shí)間的發(fā)芽生長情況.每種GA處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理100粒種子，未經(jīng)GA浸泡的作為對照試驗(yàn).迎春櫻種苗生長40 d左右具有兩片真葉時(shí)開始組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn).

參照閆道良、榮冬青鐘花櫻、野生早櫻培養(yǎng)基的配置方法[5,7,8]，配置MS+BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L的啟動培養(yǎng)基，其中pH為5.8，蔗糖30 g/L，瓊脂粉7 g/L；將生長30、40、50、60 d具有兩片真葉的迎春櫻沙床苗于超凈工作臺上，剪去幼根，無菌水沖洗3遍，70%酒精浸30 s后，0.2%HgCl2溶液浸泡3 min，取出種苗，無菌水沖洗5～6遍；將每個(gè)材料剪成帶子葉和帶真葉的莖段接種于配好的培養(yǎng)基上，每種處理接種30瓶，每瓶2個(gè)莖段.培養(yǎng)室中觀測記錄外植體啟動、污染等情況.

1.2.2 種胚外植體實(shí)驗(yàn) 按照沙床苗外植體種子檢測、消毒方法對迎春櫻種子進(jìn)行處理，去除GA溶液處理[12-15]；分別配置MS+GA0.05 g/L、MS+GA0.1 g/L、MS+GA0.15 g/L、MS+GA0.2 g/L的啟動培養(yǎng)基，以不添加任何生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的MS培養(yǎng)基作為對照，每個(gè)處理20瓶，每瓶接種3粒種子(pH、蔗糖、瓊脂粉同沙床苗實(shí)驗(yàn))；培養(yǎng)室中觀測記錄不同時(shí)期種胚的發(fā)芽、污染等情況.

1.2.3 莖段外植體實(shí)驗(yàn) 于5、6、7、8月份分別采集迎春櫻當(dāng)年生嫩枝，剪去枝條上的葉片后，用洗衣粉洗去枝條上的污漬；將枝條剪成2～3 cm帶腋芽的莖段，其中5、6、7月份接種材料均為當(dāng)年生帶腋芽莖段，8月份接種材料一部分為當(dāng)年生帶頂芽莖段，其余為腋芽莖段；于自來水下沖洗3～4 h后作為實(shí)驗(yàn)外植體；將外植體在70%酒精中浸泡30 s,0.2%的HgCl2中浸泡15 min，無菌水沖洗5～6遍后，用無菌濾紙吸干表面的水分；將消毒后的材料剪成1.5～2 cm的莖段，接種于MS+BA1 mg/L+NAA0.1 mg/L啟動培養(yǎng)基上每次接種30瓶，每瓶2個(gè)莖段；培養(yǎng)室中觀測記錄不同時(shí)期種胚的啟動、污染情況[5-8].

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為23±2℃;日光燈照明，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx;每天光照16 h.

2 結(jié)果與分析

2.1 GA處理對迎春櫻種子休眠的影響及沙床苗組培外植體的選擇

迎春櫻帶內(nèi)果皮種子于3℃低溫條件下干藏10個(gè)月后,種子生活力為97.6%，說明低溫干藏有利于迎春櫻種子保存.對赤霉素處理過的迎春櫻種子進(jìn)行沙床發(fā)芽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)赤霉素處理種子6 d后胚根伸出，對照試驗(yàn)未有胚根伸出；10 d時(shí)赤霉素處理過種子發(fā)芽率分別為 58.3%、61.7%、58.3%、65%(見表1)，對照試驗(yàn)未有種子發(fā)芽，僅有8.3%的種子有露白現(xiàn)象；20 d左右時(shí),對照實(shí)驗(yàn)開始有部分種子發(fā)芽,發(fā)芽率為5.0%;40 d時(shí)四種赤霉素濃度處理過種子發(fā)芽率接近最大值,分別為86.7%、86.7%、91.7%、96.7%，對照試驗(yàn)僅為10.0%，此時(shí)多數(shù)種苗具有2片對生真葉，未發(fā)芽種子及露白種子不再生長，對照試驗(yàn)及赤霉素濃度分別為0.05、0.1 g/L的處理種子形成的種苗開始有所污染，60 d時(shí)所有處理及對照試驗(yàn)材料污染加劇.

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果可知，迎春櫻種子具有休眠特性，僅有低溫?zé)o法有效打破迎春櫻種子的休眠作用；對低溫干藏種子進(jìn)行不同濃度赤霉素處理后，迎春櫻種子發(fā)芽率顯著提高，且隨著赤霉素濃度的提高發(fā)芽率逐漸提高，以0.2 g/L赤霉素處理過的迎春櫻種子發(fā)芽率最好，40 d時(shí)可達(dá)96.7%(如圖1),未經(jīng)赤霉素處理的對照實(shí)驗(yàn),種子發(fā)芽遲緩,且發(fā)芽率極低，據(jù)此說明赤霉素處理可有效打破迎春櫻種子的休眠作用,促進(jìn)其快速萌發(fā).

表1 不同GA濃度處理沙床苗發(fā)芽觀測結(jié)果

表2 不同生長時(shí)期沙床苗外植體接種15 d時(shí)污染、分化結(jié)果

從表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，具有兩片左右真葉的迎春櫻沙床苗于不同生長時(shí)期接種在MS+BA1 mg/L+NAA0.1 mg/L培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15 d時(shí)，芽的誘導(dǎo)及污染情況存在差別.光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)30～40 d的迎春櫻沙床苗，芽的誘導(dǎo)率較高，帶子葉外植體和未帶子葉外植體誘導(dǎo)情況近相等；用生長30、40 d的沙床苗做外植體，生長15 d時(shí)平均誘導(dǎo)率在分別為68.3%、65.0%，且污染率相對較低,平均污染率分別為18.3%、25.0%；用光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)50 d的迎春櫻沙床苗作外植體，接種后芽的誘導(dǎo)率開始下降，污染率明顯升高；光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 d的沙床苗作外植體，接種材料培養(yǎng)15 d時(shí)污染嚴(yán)重，平均污染率達(dá)75.0%.對MS+BA1 mg/L+NAA0.1 mg/L培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時(shí)間的無菌材料進(jìn)行相同培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接后生長40 d，從葉腋分化出1～3個(gè)，高2～3 cm的叢芽(如圖2).

沙床苗是由經(jīng)過消毒的迎春櫻種子發(fā)育而成，各部位器官幼嫩，且培養(yǎng)條件是在無菌的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，獲得的材料病菌較少，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，沙床苗逐漸開始污染，光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)30～40 d的迎春櫻沙床苗是較為理想的外植體材料；生長50～60 d的迎春櫻沙床苗由于自身感染病菌嚴(yán)重，作為外植體接種后污染嚴(yán)重，已不適合作外植體材料.

圖1 GA濃度為0.2 g/L的40 d沙床苗 圖2 A處理增殖芽

2.2 不同濃度GA處理的MS培養(yǎng)基對迎春櫻幼苗分化的影響

GA處理過的MS培養(yǎng)基可誘導(dǎo)成熟迎春櫻種胚形成幼苗,不同GA濃度處理的MS培養(yǎng)基對迎春櫻種胚苗的誘導(dǎo)存在差別(如表3),MS+GA0.05 g/L培養(yǎng)基對種胚苗的誘導(dǎo)率相對較高,為23.3%；對照實(shí)驗(yàn)中迎春櫻種胚苗的誘導(dǎo)率極低,僅為3.3%，明顯低于其它處理的誘導(dǎo)率；培養(yǎng)25 d時(shí),幾種處理種子污染嚴(yán)重;未萌發(fā)種子于25 d時(shí)逐漸失去活力,喪失萌發(fā)能力.

表3 不同GA處理25 d時(shí)種胚分化結(jié)果

表4 MS+BA1 mg/L+NAA0.1 mg/L培養(yǎng)基對迎春櫻芽誘導(dǎo)的結(jié)果

表5 不同處理40 d后芽苗的增殖結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)后期種子污染嚴(yán)重，未能很好反映不同濃度GA的MS培養(yǎng)基對迎春櫻種胚苗誘導(dǎo)率的大小差異，但與對照試驗(yàn)相比，赤霉素處理過的MS培養(yǎng)基可有效打破迎春櫻種子休眠，促進(jìn)其種胚苗的誘導(dǎo)，提高誘導(dǎo)率，說明基本的MS培養(yǎng)基不能有效打破迎春櫻種子的休眠作用，赤霉素處理可有效打破迎春櫻種子的休眠作用,促進(jìn)其快速萌發(fā)，這與沙床苗發(fā)芽觀測試驗(yàn)結(jié)果一致.用此種方法獲得的無菌苗進(jìn)行芽的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率在90%以上.

2.3 迎春櫻莖段外植體芽的誘導(dǎo)

由表4可知，接種于MS+BA1 mg/L+NAA0.1 mg/L培養(yǎng)基上的迎春櫻帶腋芽嫩枝莖段，培養(yǎng)25 d時(shí)觀測發(fā)現(xiàn)，芽的誘導(dǎo)率均較低，5月份芽的誘導(dǎo)率為2.8%，6月份為1.1%，7月份為0；5月份接種材料污染率較低，但褐化率高，為93.0%，6、7月份接種材料的污染率明顯提高，分為80.0 %、94.3%，褐化率也因此下降，分別為18.9%、5.7%.8月份誘導(dǎo)率為30.0%,誘導(dǎo)叢芽發(fā)生莖段均為帶頂芽的材料,當(dāng)年生帶腋芽莖段未有叢芽發(fā)生,污染、褐化材料均為帶腋芽莖段.

迎春櫻枝葉幼時(shí)毛被明顯，葉緣腺體分泌粘液，易沾染病菌，5、6、7、8月份獲得的帶腋芽莖段外植體難以像鐘花櫻、野生早櫻一樣獲得較好的叢芽誘導(dǎo)效果，褐化率、污染率較高，不適宜作為芽誘導(dǎo)的外植體材料.而正在生長的帶頂芽莖段8月份尚能有效誘導(dǎo)叢芽發(fā)生，說明迎春櫻的叢芽發(fā)生與外植體的幼嫩程度有關(guān)，帶頂芽莖段可作為迎春櫻的外植體材料.

2.4 迎春櫻叢芽增殖培養(yǎng)

將前兩種試驗(yàn)方法獲得的無菌材料分別進(jìn)行繼代轉(zhuǎn)接，其中一處理轉(zhuǎn)接至MS+BA1 mg/L+NAA0.1 mg/L培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40 d時(shí)進(jìn)行觀測記錄，記為處理A；另一種先轉(zhuǎn)接至MS+BA6 mg/L+NAA0.05 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，再轉(zhuǎn)接至MS+BA1 mg/L+NAA0.1 mg/L培養(yǎng)基上， 30 d時(shí)觀測記錄分化結(jié)果，記為處理B；第三種直接種至MS+BA6 mg/L+NAA0.05 mg/L培養(yǎng)基上，40 d時(shí)觀測記錄誘導(dǎo)分化結(jié)果，記為處理C.

由表5可知,A處理增殖系數(shù)最小,為2.2%,增殖芽數(shù)量少,但芽苗葉形正常,生長健壯(如圖2)；B處理增殖系數(shù)最大，達(dá)16.5%，增殖芽苗數(shù)量極多，但部分芽苗成蓮座狀，葉片卷縮(如圖3)；C處理芽苗介于A、B之間，增殖系數(shù)為5.8，增殖芽葉腋處又有叢芽，芽苗前期生長較快，后期生長緩慢，芽苗較生長較弱，葉片淺黃綠色(如圖4).

3種處理均能不同程度誘導(dǎo)分化出叢芽,說明迎春櫻叢芽的增殖誘導(dǎo)相對較容易；B處理中，前期培養(yǎng)基中BA含量較高，后期降低，增殖芽數(shù)最多，據(jù)此推測前期高濃度的BA刺激對迎春櫻叢芽的誘導(dǎo)有利；C處理前期芽苗增殖明顯，后期芽苗生長變?nèi)?，葉色發(fā)黃，據(jù)此推測含有高濃度BA的MS培養(yǎng)基,對迎春櫻叢芽的誘導(dǎo)有利，但對其正常生長不利.因此，迎春櫻叢芽的誘導(dǎo)可采用前期高濃度的BA刺激誘導(dǎo)叢芽，后期減少BA含量進(jìn)行增殖壯苗的方法來誘導(dǎo)分化.

3 結(jié)論與討論

低溫干藏可有效保存迎春櫻種子，但不能有效打破其休眠；不同濃度赤霉素浸泡6 h的迎春櫻種子于沙床培養(yǎng)40 d后，以0.2 g/L浸泡過的種子發(fā)芽率最高，達(dá)96.7%；接種于含有不同濃度赤霉素的MS培養(yǎng)基上的迎春櫻種子，可有效誘導(dǎo)出完整幼苗，但此種方法污染率高，誘導(dǎo)率低；兩種赤霉素處理方法均說明迎春櫻種子具有休眠作用，赤霉素處理可有效打破迎春櫻種子的休眠作用,促進(jìn)其快速萌發(fā).

圖3 B處理增殖芽 圖4 C處理增殖芽

3種外植體獲得方法中，以光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)30～40 d的迎春櫻沙床苗作為位外植體最為理想，平均誘導(dǎo)率為65.0%～68.3%；不同濃度GA處理的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)形成的無菌苗，由此種方法形成的無菌苗進(jìn)行芽的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率在90%以上，污染極少，但此種方法前期無菌苗難以獲得，誘導(dǎo)無菌苗時(shí)污染嚴(yán)重，啟動困難，浪費(fèi)種子及培養(yǎng)基；用當(dāng)年生嫩枝的帶腋芽莖段為外植體，誘導(dǎo)率最低，污染嚴(yán)重，不宜作為組培外植體材料，而以當(dāng)年生帶頂芽幼嫩莖段為外植體，芽的誘導(dǎo)發(fā)生容易，為理想的外植體取材部位.

本實(shí)驗(yàn)B處理具有較高的增殖系數(shù)，叢芽誘導(dǎo)顯著，因此，迎春櫻叢芽的誘導(dǎo)可采用前期高濃度的BA刺激誘導(dǎo)叢芽，后期減少BA含量進(jìn)行增殖壯苗的方法來誘導(dǎo)分化，具體的激素配比還需進(jìn)一步的研究.

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