劉慧君 翟克敏 趙斐 靳慶勛 喬海榮 劉洪濤 吉力立3， 張勇，

1軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所（天津 300050） 2天津體育學(xué)院天津市運(yùn)動(dòng)生理與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津 300381） 3 Department of Kinesiology，University of Wisconsin-Madison，Madison，WI53706，US

線粒體作為真核細(xì)胞的“動(dòng)力站”，在細(xì)胞中不斷地進(jìn)行著移動(dòng)、分裂與融合，線粒體移動(dòng)分布的改變會(huì)影響諸如線粒體呼吸功能、線粒體在高能量需求位置定位、Ca2+穩(wěn)態(tài)等［1］，且線粒體移動(dòng)的改變、線粒體定位異常與機(jī)體發(fā)育、多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)［2，3］。目前線粒體移動(dòng)相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)：多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中Miro和Milton形成復(fù)合物與kinesin（馬達(dá)蛋白）連接，調(diào)控線粒體沿微管的移動(dòng)［4，5］。Miro蛋白有 Miro1、Miro2兩種亞型，Miro1突變會(huì)抑制線粒體運(yùn)輸，導(dǎo)致線粒體聚集成簇，并形成絲狀線粒體［6］。Masao Saotome等研究還發(fā)現(xiàn)不同Ca2+水平下，Miro對(duì)H9C2及原代腦皮層神經(jīng)細(xì)胞線粒體融合分裂具有雙向調(diào)節(jié)作用［7］?？梢?jiàn)，Miro對(duì)維持線粒體正常的形態(tài)具有重要意義，并且可能通過(guò)線粒體形態(tài)分布的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變化調(diào)整細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域的能量分配以及促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+信息傳遞。

目前對(duì)骨骼肌這一能量代謝很旺盛的細(xì)胞線粒體移動(dòng)分布的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，且線粒體移動(dòng)是否參與了運(yùn)動(dòng)能量代謝的應(yīng)答尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以急性運(yùn)動(dòng)為模型，研究骨骼肌在運(yùn)動(dòng)能量需求變化中，線粒體移動(dòng)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，并初步探討線粒體能量代謝、H2O2生成與線粒體移動(dòng)基因動(dòng)態(tài)表達(dá)之間的可能關(guān)系及其生理意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性 C57 BL/6小鼠 40只（19～21g），7～8周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（SPF級(jí)），于正式實(shí)驗(yàn)前一周購(gòu)入，在本實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)，自由飲食，飼料為標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料。飼養(yǎng)環(huán)境為21～24℃，相對(duì)濕度45%～55%，每日光照12h。將小鼠隨機(jī)分為5組，組間體重?zé)o顯著性差異。其中1組為安靜對(duì)照組（R，n=8），4組為急性運(yùn)動(dòng)組，分別以各時(shí)間點(diǎn)代表不同組：運(yùn)動(dòng)30min組（E30，n=8）、運(yùn)動(dòng) 60min組（E60，n=8）、運(yùn)動(dòng) 90min組E90，n=8）、運(yùn)動(dòng) 120min 組（E120，n=8）。

1.2 急性運(yùn)動(dòng)模型

以跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)作為運(yùn)動(dòng)應(yīng)激模型。實(shí)驗(yàn)前所有動(dòng)物均未進(jìn)行過(guò)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。正式實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物先在跑臺(tái)上進(jìn)行5min跑步以適應(yīng)跑臺(tái)環(huán)境（0°，5m/min）。運(yùn)動(dòng)組正式實(shí)驗(yàn)采用中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)（0°，13m/min）。

1.3 骨骼肌樣品制備及線粒體的提取

安靜對(duì)照組動(dòng)物于安靜狀態(tài)、其它組于運(yùn)動(dòng)中不同時(shí)間點(diǎn)（E30、E60、E90、E120）即刻頸椎脫臼處死，迅速取出下肢骨骼肌，部分樣本液氮速凍，－80℃凍存?zhèn)溆眠M(jìn)行基因測(cè)定；另外部分骨骼肌樣本立即進(jìn)行H2O2測(cè)定及差速離心法提取線粒體。以上操作均在冰浴中進(jìn)行。

1.4 線粒體生物力能學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

用 Oxytherm液相氧電極（Hansatech，UK）測(cè)定密閉反應(yīng)體系中氧濃度的變化，以確定線粒體耗氧速率。測(cè)定以蘋(píng)果酸和丙酮酸為底物的態(tài)3、態(tài)4呼吸速率（單位為nmol/min·mg pro），呼吸控制比（respiration control rate，RCR），RCR是態(tài)3呼吸速率與態(tài)4呼吸速率的比值，此數(shù)值反映線粒體的呼吸功能。

1.5 骨骼肌H2O2的測(cè)定

根據(jù)H2O2與鉬酸銨作用生成穩(wěn)定的黃色過(guò)氧鉬酸絡(luò)合物的原理，用可見(jiàn)－紫外分光光度計(jì)（Beckman Co，USA），波長(zhǎng)405nm測(cè)定其絡(luò)合物生成量可計(jì)算H2O2的濃度。剪碎組織，去除筋膜、脂肪；加入生理鹽水，用玻璃勻漿器勻漿；2500r/min 4℃離心 10min，取上清，嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 ATP合成酶活性測(cè)定

采用熒光素－熒光素酶發(fā)光法［8］，用 20/20n型發(fā)光儀（TurnerBiosystem Co，USA）測(cè)定ATP合成酶活性。反應(yīng)溫度為25℃，在0.5ml反應(yīng)體系中含有EDTA 0.5mM，HEPES 10mM，磷酸鉀緩沖液5mM，MgCl22.5mM，熒光素－熒光素酶 100μl，0.5M 蘋(píng)果酸 /0.25M 谷氨酸，50μg線粒體。記錄以上體系中發(fā)光強(qiáng)度為本底，加入4μM ADP后啟動(dòng)線粒體ATP合成反應(yīng)，記錄發(fā)光強(qiáng)度。在不加線粒體及ADP的平行實(shí)驗(yàn)中，加1nM ATP，記錄發(fā)光強(qiáng)度作為ATP合成量的標(biāo)定（酶活力單位：nmol/min·mg pro）。

1.7 骨骼肌miro1 mRNA熒光定量PCR分析

使用 Trizol（Invitrogen）提取骨骼肌總 RNA，通過(guò)0.8%的瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)確定總RNA完整性和純度；嚴(yán)格按照RevertAid First Strand cDNA Syn thesis Kit（Fermentas）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用Applied Biosystems StepOneTMReal-Time PCR System（BIORAD，USA）進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。miro1上游引物5’-CTGATTATGTCGCTGGTCAGTGAAG-3’，下游引物 5’-GGTGACGTCAGCTGGAATGG-3’，產(chǎn)物 84bp；18S rRNA 上游引物5’-GGGAGCCTGAGAAACGGC-3’，下游引物 5’-GGGTCGGGAGTGGGTAATTT-3’，產(chǎn)物68bp。熒光定量 PCR條件：預(yù)變性 95℃/30s，95℃/5s，60℃/30s，共 40個(gè)循環(huán)。根據(jù) SYBR～Premix Ex Taq Kit（BIO-RAD）說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，目的基因的相對(duì)變化量（Fold Change）＝2－Δ（ΔCT），ΔCT=CTtarget-CT18s，Δ（ΔCT）=ΔCTstimulated-ΔCTcontrol。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miro1 mRNA含量的變化

如圖1所示，120分鐘運(yùn)動(dòng)過(guò)程中miro1 mRNA表達(dá)均較安靜組顯著升高，E30、E60、E90、E120 組分別較安靜組升高32.8%、107.6%、63.8%及44.8%，E60組達(dá)峰值。

2.2 線粒體ATP合成酶活性及呼吸速率變化

如表1所示，E30組ATP合成酶活性較安靜組明顯升高，其余各組均無(wú)明顯變化。整個(gè)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中線粒體RCR無(wú)顯著變化。

表1 急性運(yùn)動(dòng)中骨骼肌線粒體力能學(xué)分析

2.3 骨骼肌H2O2濃度變化

如圖2所示，120分鐘運(yùn)動(dòng)過(guò)程中骨骼肌H2O2均較安靜組顯著升高，其中E30、E60和E90組H2O2持續(xù)升高，分別較安靜組升高了 22.1%、26.7%、37.6%，E90組達(dá)峰值。

3 討論

近些年，越來(lái)越多的研究證據(jù)表明線粒體形態(tài)分布的動(dòng)態(tài)改變與能量代謝、細(xì)胞生理病理密切相關(guān)。線粒體與細(xì)胞骨架的相互作用會(huì)影響能量代謝及線粒體在高能量需求位置定位、Ca2+穩(wěn)態(tài)、線粒體呼吸功能、融合分裂等［2］。如：牛晶狀體表皮及上皮細(xì)胞線粒體移動(dòng)發(fā)生改變的同時(shí)線粒體內(nèi)膜電位也發(fā)生變化，揭示線粒體通過(guò)移動(dòng)使能量從線粒體網(wǎng)絡(luò)的低能量區(qū)域傳播到高能量需求區(qū)域［9］；心成肌細(xì)胞及原代腦皮層神經(jīng)細(xì)胞胞漿中游離鈣離子濃度（［Ca2+］i）水平不同時(shí)，線粒體移動(dòng)可調(diào)控線粒體融合分裂的動(dòng)態(tài)變化［7］。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：線粒體移動(dòng)參與細(xì)胞內(nèi)信息傳遞、能量交換。線粒體移動(dòng)的分子機(jī)制研究表明：線粒體移動(dòng)相關(guān)蛋白Miro屬于小GTPase家族，位于線粒體外膜，含兩個(gè)Ca2+結(jié)合的EF手型結(jié)構(gòu)域［4］。H9C2 及原代腦皮層神經(jīng)細(xì)胞中，［Ca2+］i靜息水平時(shí)，過(guò)表達(dá)Miro增強(qiáng)線粒體移動(dòng)并促進(jìn)線粒體趨于融合；［Ca2+］i升高或鈣振蕩時(shí)，過(guò)表達(dá)Miro促進(jìn)線粒體趨于分裂［7］。COS-7及HEK293T細(xì)胞中Miro1突變導(dǎo)致線粒體聚集成簇，形成絲狀線粒體，影響線粒體移動(dòng)及分布［6］。果蠅缺失dmiro會(huì)影響線粒體沿微管移動(dòng)，導(dǎo)致部分神經(jīng)傳遞功能缺失［10］。截至目前，運(yùn)動(dòng)應(yīng)激過(guò)程中，骨骼肌這一能量代謝很旺盛的組織與線粒體移動(dòng)分布的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)：一次中等強(qiáng)度負(fù)荷急性運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，C57小鼠骨骼肌miro1 mRNA表達(dá)均較安靜組顯著升高，其中E60組較安靜組升高了107.6%。這說(shuō)明急性運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，線粒體移動(dòng)相關(guān)基因miro1表達(dá)迅速增加，線粒體可能通過(guò)移動(dòng)、動(dòng)態(tài)分布的改變適應(yīng)細(xì)胞能量需求的急劇變化。

此外，本研究結(jié)果表明：急性運(yùn)動(dòng)中E30組ATP合成酶活性較安靜組顯著增加，其余各組無(wú)明顯變化；整個(gè)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中線粒體呼吸控制比較安靜組升高，但無(wú)顯著性變化。這說(shuō)明急性運(yùn)動(dòng)初期線粒體ATP合成速率加快，在急性運(yùn)動(dòng)時(shí)間延續(xù)過(guò)程中線粒體能量代謝水平尚可滿足能量需求的變化。以上結(jié)果提示：急性運(yùn)動(dòng)中，因線粒體移動(dòng)相關(guān)基因miro1表達(dá)增加而活躍的骨骼肌線粒體移動(dòng)，可能利于促進(jìn)線粒體呼吸和ATP合成，以應(yīng)對(duì)組織能量需求的變化。

是什么因素誘導(dǎo)線粒體移動(dòng)基因表達(dá)迅速增高，擬或也對(duì)能量需求變化產(chǎn)生快速應(yīng)答？盡管目前對(duì)線粒體移動(dòng)調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚不清晰，但相關(guān)研究表明：多種細(xì)胞中局部Ca2+、NO濃度變化均可調(diào)控線粒體移動(dòng)動(dòng)態(tài)改變［11，12］。本研究結(jié)果表明：急性運(yùn)動(dòng)中骨骼肌 H2O2均較安靜組顯著升高，其中E30、E60和E90組H2O2持續(xù)升高，E90組達(dá)峰值，E120組比E90組略有降低但仍明顯高于安靜組。已知線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的超氧陰離子（O2-·）、H2O2等自由基是細(xì)胞中ROS的95%來(lái)源，它們對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡調(diào)控等都有重要作用。研究表明，細(xì)胞內(nèi)ROS信號(hào)系統(tǒng)與鈣信號(hào)系統(tǒng)之間具有密切的相互作用［13，14］。根據(jù)已有研究及本文現(xiàn)有結(jié)果提示：一次急性運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞對(duì)能量需求急劇增加的同時(shí)伴隨H2O2生成急劇增多，H2O2可能作為信號(hào)分子調(diào)控Ca2+，Ca2+與線粒體移動(dòng)相關(guān)蛋白miro結(jié)合影響線粒體移動(dòng)［7，15］，調(diào)節(jié)線粒體在工作細(xì)胞內(nèi)的重新分布，從而有助于線粒體與胞漿和其它細(xì)胞器之間的物質(zhì)、信息和能量交換。

目前，對(duì)線粒體移動(dòng)的研究尚不夠深入，還未見(jiàn)骨骼肌細(xì)胞線粒體移動(dòng)的報(bào)道，以至于我們對(duì)其具體的調(diào)控機(jī)制和生理意義知之甚少。本文在急性運(yùn)動(dòng)中發(fā)現(xiàn)的骨骼肌線粒體移動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)特征，是否作為一個(gè)與運(yùn)動(dòng)能量代謝相關(guān)的“早期細(xì)胞事件”參與了線粒體的能量轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)，這一事件與ROS和Ca2+等信號(hào)分子作用的關(guān)系及其是否通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體融合與分裂影響線粒體動(dòng)態(tài)重構(gòu)等值得待進(jìn)一步深入研究。

4 總結(jié)

C57 BL/6小鼠一次中等強(qiáng)度負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)中，與安靜對(duì)照組相比miro1 mRNA表達(dá)顯著增加，骨骼肌H2O2顯著增高，E30組ATP合成酶活性明顯增加，線粒體呼吸控制比無(wú)顯著變化。提示急性運(yùn)動(dòng)中骨骼肌線粒體移動(dòng)相關(guān)基因miro表達(dá)增加，可能利于促進(jìn)線粒體呼吸和ATP合成，以應(yīng)對(duì)工作細(xì)胞能量需求的變化。

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