彭澤胄 常蕓

國家體育總局體育科學(xué)研究所（北京 100061）

適宜負荷訓(xùn)練可引起心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的可調(diào)節(jié)性、生理性重塑，有利于心臟功能的改善。然而，持續(xù)大強度運動和急性力竭運動等超負荷運動常引起運動性心肌微損傷［1］。在正常情況下，心肌細胞表面的細胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecules-1，ICAM-1）表達量極低，但炎性細胞因子（TNF、IL-1）［2，3］和脂多糖等可誘導(dǎo)心肌細胞中ICAM-1表達增強，促使炎性細胞的粘附和浸潤，并釋放有害物質(zhì)，從而引起心肌細胞凋亡或壞死，但目前仍缺乏系統(tǒng)的有關(guān)過度訓(xùn)練引起的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致心肌微損傷的研究。本實驗采用一次力竭游泳和反復(fù)力竭游泳運動建立運動性心肌微損傷的實驗動物模型，觀察大鼠心肌ICAM-1蛋白在力竭運動后不同時相的表達變化，探討其在運動性心肌微損傷及心肌功能異常發(fā)生中的調(diào)節(jié)作用，為心肌微損傷機制提供理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組

健康雄性SD大鼠100只（維通利華公司提供），2月齡，體重219±8g。國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動物飼料喂養(yǎng)，自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫18±2℃，光照時間12小時，相對濕度40%～55%。將大鼠隨機分為一次力竭游泳運動組（n=40）、2周反復(fù)力竭游泳運動組（n=40）及相應(yīng)對照組。

1.2 動物模型的建立

PVC特制泳池，規(guī)格為 1.6m×0.8m×1.2m，內(nèi)壁光滑，水深約60cm，超過大鼠身長2倍，控制水溫在30～33℃。安靜對照組不運動。運動組大鼠進入動物房后首先適應(yīng)3天，然后進行2天適應(yīng)性游泳運動（20min/次）。一次性力竭組進行一次性游泳運動，游泳大鼠在尾部負重為體重3%，直至力竭，力竭標(biāo)準(zhǔn)參照Thomas DP報道［4］，即連續(xù)沉入水中超過 10秒，撈出后置于平面不能完成翻正反射；在相對短時間內(nèi)力竭的大鼠，將其撈出休息5分鐘后，再繼續(xù)進行游泳運動，使每次運動時間不少于2小時。反復(fù)力竭運動組每天1次力竭運動，游泳大鼠在尾部負重為體重3%。每周運動6天，共運動2周。每次運動時間不少于2小時。每次運動后，迅速用干毛巾擦干水分，電吹風(fēng)吹干后，放回籠中休息。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠心肌取材

一次和反復(fù)力竭運動組分別于力竭運動后0、6、12、24小時取材。100只大鼠全部進入取材階段。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（1ml/100g體重）麻醉，開胸后迅速取出心臟，經(jīng)滅菌生理鹽水清洗后，濾紙吸干并稱重，然后迅速垂直于心臟長軸切取心肌組織兩塊，其中近心尖心肌組織投入福爾馬林液固定24小時后于石蠟切片機切取5μm厚的石蠟切片備用，近心底心肌組織置于冰凍切片樣品托，滴加OCT包埋劑后置于液氮冷凍20秒后轉(zhuǎn)入冰凍切片機恒溫箱，切取7μm厚的冰凍切片置于－70℃超低溫冰箱備用。

1.3.2 免疫熒光染色

主要試劑：羊多克隆ICAM-1抗體購于北京中杉生物技術(shù)有限公司；FITC標(biāo)記兔抗山羊IgG購于北京中杉生物技術(shù)有限公司；德克薩斯紅標(biāo)記的麥芽凝集素購于美國Invitrogen公司。

由于ICAM-1在心肌細胞膜上表達，為了更好的定位，采用雙熒光標(biāo)記，用紅色熒光標(biāo)記細胞膜，綠色熒光標(biāo)記ICAM-1，具體步驟如下：（1）將－70℃超低溫冰箱保存的冰凍切片取出，室溫復(fù)溫30分鐘后入4℃丙酮固定10分鐘，PBS 漂洗 5分鐘×3；（2）100μg/ml的德克薩斯紅標(biāo)記的麥芽凝集素（美國Invitrogen公司）室溫孵育45min，經(jīng) PBS漂洗 5分鐘×3；（3）10%正常兔血清封閉，室溫孵育15分鐘；（4）傾去血清，勿洗，滴加1∶50稀釋的山羊抗大鼠ICAM-1（北京中杉金橋生物公司），4℃過夜，PBS漂洗 5分鐘×3次；（5）滴加1∶50稀釋的 FITC標(biāo)記兔抗山羊IgG，37℃溫箱孵育1小時，PBS漂洗5分鐘×3次；（6）60%的緩沖甘油封片。

1.3.3 圖像采集與分析

主要儀器：Leica 4000圖像分析儀，單色激發(fā)光源，放大倍數(shù)為200倍，圖像存為1024×1024像素類型。每張切片左室、室間隔、右室各隨機選擇6個視野，采用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)對所拍圖像熒光強度進行定量，熒光強度用積分灰度代表，參考陰性對照標(biāo)本中熒光強度，灰度值在40～130之間為蛋白陽性表達。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行處理，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用多因素方差分析，P<0.05為顯著性水平，P<0.01為非常顯著性水平。

2 結(jié)果

由圖1可見，F(xiàn)ITC標(biāo)記蛋白陽性表達呈綠色熒光，基本位于德克薩斯紅標(biāo)記細胞膜（紅色熒光）的位置，對照組熒光強度最弱，其他各組熒光染色面積及強度均有不同程度的升高。各運動組積分灰度值均不同程度高于對照組，其中以一次力竭即刻和反復(fù)力竭運動后6小時最為典型。

2.1 一次力竭運動后大鼠心肌細胞內(nèi)ICAM-1蛋白表達的變化

如表1所示，一次性力竭游泳后，運動后即刻組大鼠心肌各部位ICAM-1快速表達，蛋白含量均顯著高于對照組（P<0.01）；運動后 6小時組ICAM-1蛋白含量達到峰值，并顯著高于其他各時相組（P<0.01）；運動后12小時組和24小時組心肌各部位ICAM-1蛋白表達呈下降趨勢，但仍高于對照組（P<0.01）。

表1 一次力竭運動后心肌ICAM-1蛋白表達總灰度值變化情況

2.2 反復(fù)力竭運動后大鼠心肌細胞內(nèi)ICAM-1蛋白表達的變化

如表2所示，反復(fù)性力竭游泳后，大鼠心肌各部位ICAM-1蛋白含量在力竭后即刻、6小時組和 12小時組與對照組相比均有顯著性差異（P<0.01）；左心室ICAM-1蛋白含量在力竭后24小時高于對照組（P<0.05），室間隔和右心室ICAM-1蛋白含量在力竭后24小時與對照組相比無顯著性差異（P>0.05）；反復(fù)力竭后6小時心肌各部位ICAM-1蛋白含量顯著高于各時相組（P<0.01）。

表2 反復(fù)力竭運動后ICAM-1蛋白表達總灰度值變化情況

2.3 兩種不同力竭運動后心肌各部位ICAM-1蛋白表達的變化

兩種不同力竭運動后各部位ICAM-1蛋白表達趨勢基本一致，但表達量存在差異。大鼠心肌各部位ICAM-1含量反復(fù)力竭運動后即刻組顯著高于一次力竭后即刻組（P<0.01）；力竭運動后6小時蛋白表達均達到峰值，在左心室和室間隔處，兩種力竭運動之間蛋白含量無顯著性差異（P>0.05），而反復(fù)力竭后 6小時組右心室 ICAM-1含量顯著高于一次力竭運動組（P<0.01）；力竭運動后12小時組一次力竭運動后大鼠心肌各部位ICAM-1含量均顯著高于反復(fù)力竭組（P<0.01）；力竭運動后24小時組一次力竭后左心室ICAM-1含量高于反復(fù)力竭組（P<0.05），室間隔和右心室ICAM-1含量顯著高于反復(fù)力竭組（P<0.01）。

3 討論

研究表明，心肌局部或全身性炎癥反應(yīng)不管在缺血再灌注后，還是其他因素引起的心肌損傷的發(fā)病過程中都起著重要作用。王嵐峰［5］通過研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死（AMI）后炎癥指標(biāo)明顯升高，并且炎癥指標(biāo)越高，微循環(huán)灌注越嚴(yán)重。另外，占成業(yè)等［6］對高血壓左室肥厚時ICAM-1在心肌中的表達研究發(fā)現(xiàn)，心肌ICAM-1 mRNA和蛋白表達水平及巨噬細胞浸潤顯著增加，心肌ICAM-1過度表達及其介導(dǎo)的炎性細胞浸潤可能參與了高血壓左室肥厚的發(fā)病過程，提示炎癥反應(yīng)參與心肌損傷的發(fā)病過程。而趙敬國［7］從運動引起心肌損傷的角度，對一次性力竭運動后不同時相心肌的光鏡結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一系列的動態(tài)改變進行觀察，發(fā)現(xiàn)運動后即刻部分心肌纖維變性、濁腫、毛細血管充血；3小時可見有少數(shù)炎癥細胞浸潤；24小時則可見心肌細胞點狀壞死及炎細胞浸潤灶。這提示一次性力竭運動后有炎癥反應(yīng)參與。但炎癥反應(yīng)是否參與運動性心肌微損傷及具體機制目前還未見報道。

ICAM-1屬于粘附分子免疫球蛋白超家族類，在體內(nèi)分布廣泛，包括各種上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、單核巨噬細胞和淋巴細胞，心肌細胞也能表達ICAM-1。在多種炎性介質(zhì)（如TNF-α、IL-1等）的刺激下，通過激活核因子KappaB（NF-KB）、活化蛋白-1（AP-1）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（STAT）等，可促進ICAM-1分子的表達上調(diào)［8，9］，并參與多種細胞信號傳導(dǎo)，引起細胞骨架蛋白結(jié)構(gòu)與功能的改變，參與調(diào)節(jié)機體的正常生長發(fā)育，參與調(diào)節(jié)免疫細胞的分化，促進細胞間粘附及細胞活化，參與細胞因子產(chǎn)生。近年來的研究表明，ICAM-1的異常表達與心肌損傷、心功能衰竭、心臟移植排斥等多種心血管疾病的發(fā)病及治療有關(guān)［10］。

研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1通過與LFA-1結(jié)合參與炎癥反應(yīng)免疫細胞作用、微血管損害、血栓形成及缺血再灌注損傷等病理過程。吳弘等［11］通過實驗觀察缺氧/復(fù)氧對心肌細胞與PMN粘附效應(yīng)的影響及ICAM-1和淋巴細胞功能相關(guān)抗原（LFA-1）在PMN介導(dǎo)的心肌細胞損傷中的作用發(fā)現(xiàn)，缺氧/復(fù)氧使心肌細胞與PMN粘附效應(yīng)增加，心肌細胞損傷加重，ICAM-1和LFA-1參與這一過程；毛宗珍等［12］通過建立不同負荷大鼠運動模型，觀察大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)及ICAM-1表達發(fā)現(xiàn)，一般訓(xùn)練組心肌呈與有氧代謝相適應(yīng)的生理性肥大，心肌細胞ICAM-1表達為陰性；過度負荷組大鼠心肌呈現(xiàn)病理性改變，心肌細胞ICAM-1表達明顯增多。

本實驗結(jié)果顯示，反復(fù)進行的持續(xù)大強度運動和急性力竭運動可對機體產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致運動性疲勞與損傷發(fā)生，尤其是運動性心肌微損傷，這種損傷在6小時的時相較嚴(yán)重，24小時后有所減輕，這些特點與臨床上的缺血再灌注損傷相似。由于運動性缺氧復(fù)氧過程對心肌結(jié)構(gòu)功能的影響與臨床醫(yī)學(xué)中的心肌缺血再灌注損傷癥狀十分相似，我們可將這種由于劇烈運動及運動后恢復(fù)期而引發(fā)心肌缺氧復(fù)氧過程，從而導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)功能的改變稱之為運動性缺血再灌注損傷。在對力竭運動后不同時相大鼠心肌ICAM-1的觀察中發(fā)現(xiàn)，兩種不同力竭運動后6小時組ICAM-1含量表達出現(xiàn)最高值，我們認為這是缺血再灌注的直接表現(xiàn)。正常情況下，心肌ICAM-1很少表達，心肌缺血時促使心肌分泌促炎因子，激活了ICAM-1的表達，促進中性粒細胞與心肌細胞的粘附并發(fā)揮其毒害作用，直接導(dǎo)致了心肌損傷，這與Lee等［13］對心肌損傷機制的研究結(jié)果類似。另外，Polazzo［14］用ICAM-1基因被敲出的鼠進行心肌缺血再灌注實驗發(fā)現(xiàn)，與正常鼠相比，ICAM-1基因陰性鼠心肌損傷程度明顯減輕；ICAM-1基因陰性鼠重新轉(zhuǎn)染ICAM-1基因，再進行缺血再灌注實驗，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ICAM-1基因鼠心肌損傷程度明顯加重，用ICAM-1單克隆抗體可減輕缺血再灌注造成的心肌損害，說明ICAM-1對心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生有重要意義。當(dāng)發(fā)生炎癥反應(yīng)等病理過程時，血管內(nèi)滾動的PMN通過其LFA-1與VEC上的ICAM-1結(jié)合，從而相互粘附。一旦粘附發(fā)生后即可通過多種機制損傷組織，如進一步吸附血小板及PMN造成毛細血管堵塞呈無血流狀態(tài)，此時微循環(huán)中的PMN與心肌細胞只隔一層VEC，PMN可釋放OFR、彈性蛋白酶等損傷介質(zhì)直接擴散到心肌細胞產(chǎn)生損傷；PMN還可跨膜遷移到ICAM-1表達增加的心肌細胞內(nèi)，直接釋放溶細胞物質(zhì)如穿孔素等造成心肌細胞壞死。

本研究發(fā)現(xiàn)，兩種力竭運動后即刻，大鼠心肌ICAM-1含量明顯上升，力竭后6小時達到最高值，這與缺血再灌注對心肌造成的損傷時相趨勢一致。雖然運動性缺血再灌注損傷是在機體保護性抑制系統(tǒng)監(jiān)控下發(fā)生的一個主動缺氧的過程，但是反復(fù)力竭運動能夠引起過度疲勞，導(dǎo)致心肌超微結(jié)構(gòu)嚴(yán)重紊亂、心律失常、心功能降低等情況，使結(jié)構(gòu)功能出現(xiàn)不可逆的改變。在一次力竭后24小時組中，大鼠心肌各部位ICAM-1含量與對照組相比均有顯著差異，說明在一次力竭24小時后，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)的損傷和功能上的改變，在短時間內(nèi)無法完全恢復(fù)；而反復(fù)力竭24小時組心臟左心室ICAM-1含量顯著高于對照組，右心室和室間隔ICAM-1含量與對照組無顯著性差異，說明兩種情況，一是反復(fù)力竭運動后心肌炎癥反應(yīng)基本恢復(fù)到正常水平；二是心肌細胞壞死導(dǎo)致產(chǎn)生ICAM-1減少，所以蛋白含量與對照組無顯著性差異。

在對兩種力竭運動各時相的觀察中，在一次力竭運動后即刻、6小時和12小時左心室ICAM-1含量要高于室間隔和右心室，推測在力竭運動過程中，心臟以提高心率來維持心輸出量，左心室在快速收縮泵血的過程中，容易造成自身缺血缺氧的狀態(tài)，從而引起炎癥反應(yīng)的速度和程度要快于室間隔和右心室；一次力竭后24小時左心室ICAM-1含量低于室間隔和右心室，這可能與左心室在力竭運動后恢復(fù)時供血充足有關(guān)，也有可能是左心室心肌壞死程度要高于室間隔和右心室；而反復(fù)力竭后即刻、12小時和24小時左心室ICAM-1含量高于室間隔和右心室，由于反復(fù)力竭對心肌造成的損害遠遠大于一次性力竭，在恢復(fù)過程中，復(fù)氧復(fù)血反而加重了心肌損傷，這與缺血再灌注造成心肌損傷的結(jié)果類似。另外，在對大鼠心肌各部位進行一次性力竭和反復(fù)性力竭比較發(fā)現(xiàn)，反復(fù)性力竭后即刻組大鼠心肌各部位ICAM-1蛋白含量均顯著高于一次性力竭后即刻組，說明反復(fù)力竭運動對大鼠心肌造成的缺血缺氧程度要大于一次性力竭運動，促使大鼠心肌快速表達；此外，兩種力竭運動之間比較，一次性力竭運動后12小時組和24小時組大鼠心肌各部位ICAM-1含量要顯著高于反復(fù)力竭運動，推測反復(fù)力竭后大鼠心肌對缺血缺氧耐受性提高，恢復(fù)程度要好于一次力竭運動；另外一種可能是反復(fù)力竭不僅僅只引起心肌發(fā)生微損傷，甚至引起心肌壞死，在ICAM-1介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的過程中過度耗竭，或者是壞死的心肌細胞產(chǎn)生的ICAM-1減少等緣故。

4 總結(jié)

4.1 一次力竭運動和反復(fù)力竭運動后心肌各部位出現(xiàn)ICAM-1表達上升，心肌呈現(xiàn)缺血缺氧性改變，其改變可能與急性大強度運動引起炎癥反應(yīng)造成心肌損傷有關(guān)。

4.2 力竭運動后心肌在缺血缺氧的條件下刺激ICAM-1的快速表達，可誘導(dǎo)細胞因子的激活，介導(dǎo)心肌細胞的粘附和浸潤等炎癥反應(yīng)，構(gòu)成運動性心肌微損傷的發(fā)生機制之一。

4.3 力竭運動后24小時ICAM-1不同程度下降，也提示急性大強度運動后心肌ICAM-1改變可能具有可恢復(fù)性，有別于病理性改變。

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