何明霞，張素娟，李進才，李 萌，張 旭

(1. 天津大學精密測試技術及儀器國家重點實驗室，天津 300072；

2. 天津大學農業(yè)與生物工程學院，天津 300072)

葉綠素是植物吸收光能進行光合作用的物質基礎，葉片的葉綠素含量與植物光合速率、營養(yǎng)狀況等密切相關[1-2]．實時、快速、非破壞性的便攜式葉綠素儀，在植物生理研究和營養(yǎng)診斷等方面有一定的應用價值[3-5]．日本、美國、英國等對便攜式葉綠素儀進行了研究開發(fā)．日本研制的便攜式葉綠素儀 SPAD502在我國得到了廣泛應用[6-8]．其工作原理是以波長940,nm的紅外光作透射參照，檢測波長650,nm紅光的吸光度[9]．目前我國對葉綠素儀的開與國外存在一定差距，因此，開發(fā)研制了用于檢測植物葉片對紅光(R)、綠光(G)、藍光(B)吸光度的便攜式RGB葉綠素儀[10]．并且，為了使 RGB葉綠素儀測量值準確反映葉綠素含量，根據朗伯-比耳定律(Lambert-Beer law)和吸光度的加和性，建立了 RGB頻率的對數(shù)值與葉綠素含量的回歸數(shù)學模型[11-14]．通過對綠色程度不同的彩紙、黃瓜葉片的檢測對回歸模型進行了驗證，為RGB葉綠素儀植物葉片葉綠素含量檢測奠定了一定的應用基礎．

1 RGB測量數(shù)據處理的理論基礎

1.1 朗伯-比耳定律和吸光度加和性

所研制開發(fā)的便攜式 RGB葉綠素儀以白光LED作測試光源，包括 LED光源模塊、RGB顏色傳感器模塊、LCD液晶顯示模塊和數(shù)據存儲器模塊[10]，如圖 1所示．利用該儀器獲得植物葉片的透射光的紅光(R)、綠光(G)、藍光(B)吸光度值，并由朗伯-比耳定律和吸光度的加和性，建立回歸數(shù)學模型，得到植物葉片的葉綠素含量．

圖1 葉綠素儀系統(tǒng)示意Fig.1 Block diagram of chlorophyll meter

朗伯-比耳定律：有色溶液對光的吸收程度與溶液的濃度、液層的厚度及入射光的波長有關，如果入射光的波長不變，光吸收的程度就只與溶液的濃度和液層厚度有關，數(shù)學表達式為

式中：A為吸光度；I0為入射光強度；It為透射光強度；T為透光率；K為一定溫度下吸光物質在特定波長和特定溶劑的特征常數(shù)；b為液層厚度；c為溶液濃度．有色溶液是朗伯-比耳定律適用條件，但此定律也可用于葉片葉綠素含量的測量．所研制的 RGB葉綠素儀測量原理與日本研制的葉綠素儀SPAD502都是以朗伯-比耳定律為理論基礎的．

吸光度的加和性：如果溶液中有數(shù)種吸光物質，此混合液在某一波長下的吸光度等于各組分在該波長下吸光度的總和，數(shù)學表達式為

1.2 RGB數(shù)據的朗伯-比耳處理與加和性處理

RGB葉綠素儀測試白光穿過植物葉片時，R、G、B三種光光強會發(fā)生衰減，衰減的一部分由葉綠素吸收引起，另一部分由葉片中其他物質的吸收或遮擋引起，其他因素引起的衰減可看成是由一種特殊濃度吸光物質引起的，根據朗伯-比耳定律和吸光度加和性建立RGB葉綠素儀測量值與葉綠素含量的關系有

式中：R0為發(fā)射紅光強度；Rt為透射紅光強度；KR為紅光與葉綠素間比例常數(shù)；Kxr為紅光與特殊吸光物質間比例常數(shù)；G0為發(fā)射綠光強度；Gt為透射綠光強度；KG為綠光與葉綠素間比例常數(shù)；Kxg為綠光與特殊吸光物質間比例常數(shù)；B0為發(fā)射藍光強度；Bt為透射藍光強度；KB為藍光與葉綠素間比例常數(shù)；Kxy為藍光與特殊吸光物質間比例常數(shù)；b為葉片厚度；c為葉綠素濃度；cx為特殊吸光物質濃度．將式(3)、式(4)和式(5)加權相加，則得

朗伯-比耳定律成立條件為單色光，RGB葉綠素儀測試光是非單色光，在非單色光條件下朗伯-比耳定律會產生偏離[11]，因此，需要對式(6)進行修正，得

修正后，RGB葉綠素儀測量值與植物葉片葉綠素含量間關系為式(7)．為驗證式(7)的有效性，對綠色程度不同的彩紙進行了檢測．綠色彩紙的穩(wěn)定性相對葉片更好，且彩紙顏色變化量與變化范圍可以控制，是一種理想的試驗材料．由于葉綠素含量值與 SPAD值線性相關[6]，式(7)可寫為

2 RGB葉綠素儀用于彩紙和黃瓜葉片測試試驗

2.1 RGB葉綠素儀彩紙測試試驗

以 17張綠色程度不同的彩紙為檢測對象，每張彩紙分別用 RGB葉綠素儀和 SPAD502儀進行多點測量并求其平均值，根據 RGB對數(shù)值與 SPAD值進行多元線性回歸分析[15]得到方程

線性相關系數(shù)r＝1.000，大于置信度0.01時的相關系數(shù) 0.721，回歸方程極顯著，說明 RGB對數(shù)值與SPAD值間線性關系是真實的，式(7)得到初步驗證．SPAD502儀測得的SPAD值為實測SPAD值，將彩紙實測 RGB值代入式(9)，得到預測 SPAD值，在圖2中分別用橫坐標x與縱坐標y表示．圖2中直線表示x＝y(tǒng)的理想值曲線．

圖2 實測SPAD值與預測SPAD值關系(r＝1.000)Fig.2 Relationship between measured SPAD values and/predicted SPAD values(r＝1.000)

2.2 RGB葉綠素儀黃瓜葉片測試實驗

2.2.1 黃瓜葉片測試方法

為進一步驗證式(8)的實用性，將RGB葉綠素儀用于黃瓜葉片的檢測．首先，對一組黃瓜葉片測量，建立了RGB對數(shù)值與黃瓜葉片葉綠素含量的多元線性回歸方程．然后，用另一組黃瓜葉片測量值檢測回歸方程的有效性．最后，將 RGB葉綠素儀測量效果與SPAD502測量效果進行比較．

第1組黃瓜葉片為21片，第2組為19片．每片葉為一樣本，各樣本分別用RGB葉綠素儀、SPAD502和分光光度計進行測量，獲得每片葉的對應的 RGB值、SPAD值、葉綠素含量．利用打孔器在每片葉上取8小片子樣品(頂部、中上部、中下部、底部各取 2小片)，用于 RGB儀、SPAD儀的測量，每片葉子樣品的RGB值、SPAD值為8個樣品RGB值、SPAD值的平均值，分別用 Rt、Gt、Bt、SPAD 表示．再用分光光度計進行每片葉子葉綠素含量的測定，測量值定義為用實測葉綠素含量．

2.2.2 黃瓜葉片RGB測量數(shù)據分析

利用第1組黃瓜葉片的實測葉綠素含量與RGB值，通過 Matlab數(shù)據處理工具，對式(8)進行線性回歸，建立了 RGB對數(shù)值與葉綠素含量的多元線性回歸方程，葉綠素含量用Y表示，得到

將第2組黃瓜葉片的RGB儀測得值代入回歸方程(10)，得到葉綠素含量的預測值 Y．圖 3(a)與圖3(b)分別表示實測葉綠素含量與 2組黃瓜葉片預測葉綠素含量的關系，圖中直線表示實測葉綠素含量值等于預測葉綠素含量時的理想狀態(tài)．

分析圖3(a)曲線預測值與實測值的相關系數(shù)r＝0.755，大于置信度0.01時的相關系數(shù)0.665．圖3(b)曲線的預測值與實測值的相關系數(shù)為 r＝0.727，大于置信度 0.01時的相關系數(shù) 0.691，仍為極顯著．由此可以說明，建立的回歸方程(10)的有效性，以及 RGB葉綠素儀測量黃瓜葉片葉綠素含量模型回歸方程(8)的實用性．

2.2.3 黃瓜葉片 SPAD502測量數(shù)據分析及與 RGB測量數(shù)據比較

利用第 1組黃瓜葉片的實測葉綠素含量與SPAD502測得的SPAD值，通過Matlab數(shù)據處理工具，對式(8)進行線性回歸，建立SPAD值與葉綠素含量間線性回歸方程，葉綠素含量用Y表示，得到方程為

將第 2組黃瓜葉片的 SPAD值代入回歸方程(11)，得到葉綠素含量的預測值Y．圖4(a)與圖4(b)分別表示實測葉綠素含量與 2組黃瓜葉片預測葉綠素含量的關系，圖中直線表示實測葉綠素含量值等于預測葉綠素含量時的理想狀態(tài)．

圖3 實測葉綠素含量與RGB儀預測葉綠素含量關系Fig.3 Relationship between measured chlorophyll content,and predicted RGB ones

圖4 實測葉綠素含量與SPAD預測葉綠素含量關系Fig.4 Relationship between measured chlorophyll content,and predicted SPAD ones

分析圖 4(a)和(b)，其預測值與實測值的相關系數(shù)分別為0.880和0.755．大于置信度0.01時的相關系數(shù) 0.691，仍為極顯著．由此可以說明，建立的回歸方程(11)的有效性，以及 RGB葉綠素儀測量黃瓜葉片葉綠素含量模型回歸方程(8)的實用性．

比較圖 3(a)和圖 4(a)曲線的的相關系數(shù)，分別是 0.755和 0.880，即 RGB葉綠素儀和 SPAD502儀測量值比較，可以得出：SPAD502儀測得的 SPAD值與葉綠素含量值之間的線性度，要好于 RGB葉綠素儀．比較第 2組黃瓜葉片測量值，即圖 3(b)和圖4(b)曲線的的相關系數(shù)分別為 0.727和 0.702，RGB葉綠素儀在測量重復性好于SPAD502儀．表明RGB葉綠素儀對植物葉片葉綠素的含量的測量，有其獨特的優(yōu)越性．

3 結 語

根據朗伯-比耳定律和吸光度加和性，分析并建立了RGB葉綠素儀測量數(shù)據處理模型——多元線性方程，并利用綠色程度不同的彩紙進行試驗，初步證實該測量方法的有效性．通過對黃瓜葉片進行測量，得到了RGB葉綠素儀黃瓜葉片葉綠素含量測量關系式，并用 SPAD502儀對黃瓜葉片葉綠素含量進行測量，比較了 RGB葉綠素儀、SPAD502對黃瓜葉片葉綠素含量測量效果，證明了 RGB葉綠素儀測量方法的實用性．此外，RGB葉綠素儀比 SPAD502儀包含更多的光強信息，可用于植物葉片與其他生物中某物質含量的測量，如紅發(fā)夫酵母中蝦青素含量的測量．

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