韓坤 李德恒 袁磊

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生理教研室,河南 漯河 462002)

胰島素抵抗指胰島素在周圍組織攝取和清除葡萄糖的作用減低,在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下,肝糖原分解增加,糖異生作用增強,導(dǎo)致肝糖輸出增多[1]。近年來,噻唑烷二酮類藥物(Thiazolidinedionederivatives,TZDs)因其可改善組織的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),增強組織對胰島素的敏感性而越來越受到重視[2,3]。

本研究采用3T3-L1脂肪細(xì)胞復(fù)制胰島素抵抗模型[4],觀察TZDs類藥物吡格列酮對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗及糖異生作用的影響,進(jìn)一步在細(xì)胞水平明確吡格列酮對糖代謝影響的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞所),地塞米松與3-異丁基-1-甲基黃嘌呤均(Sigma),胰島素注射液(諾和公司),DMEM培養(yǎng)基(Gibco),乳酸鈉(上?；瘜W(xué)試劑總廠上海試劑三廠),考馬斯亮蘭法總蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所),葡萄糖臨床檢測試劑盒(四川邁克公司)。

1.2 實驗儀器 酶標(biāo)儀(Thermo Electron),CO2培養(yǎng)箱(Forma Scientific),超凈工作臺(北京半導(dǎo)體廠),倒置顯微鏡(Olympus IX),BP210S電子天平(賽多利斯有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 3T3-L1脂肪細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)[5]參考AnilKumar[6]分化前脂肪細(xì)胞的方法,對細(xì)胞進(jìn)行分化：將3T3-L1前脂肪細(xì)胞置于含10%小牛血清的DM EM 高糖培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。待細(xì)胞融合2d后,加入含0.5 mmol?L-13-異丁基-1-甲基黃嘌呤、0.25μ mol? L-1地塞米松、10mg? L-1胰島素以及10%小牛血清的DM EM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48h,換含10 mg?L-1胰島素的培養(yǎng)基再培養(yǎng) 48 h,隨后以 10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2d,換培養(yǎng)液1次,誘導(dǎo)分化8～12 d的3T3-L1細(xì)胞90%以上呈脂肪細(xì)胞表型可用于試驗。

1.3.2 3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立[7,8]將上述分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度轉(zhuǎn)入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng),分為空白組及模型組,空白組加入正常培養(yǎng)基,模型組加入含終濃度為 1μ mol?L-1地塞米松的培養(yǎng)基,孵育48h,孵育結(jié)束后,棄去培養(yǎng)液,用PBS輕輕洗滌2次,即為正常對照3T3-L1脂肪細(xì)胞和胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞模型。

1.3.3 吡格列酮對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響[9]將上述分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度轉(zhuǎn)入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),細(xì)胞密度為3×105個?孔-1,復(fù)制上述胰島素抵抗模型。將細(xì)胞分為正常細(xì)胞對照組,模型組和吡格列酮組(濃度為 10-5mol?L-1)孵育12h后,再按是否加入生理濃度的胰島素(10-9mol?L-1)將各組均分為兩個平行組,繼續(xù)溫浴12h,并設(shè)無細(xì)胞培養(yǎng)基對照組,取各組上清液用GOD-POD法(葡萄糖氧化酶法)測定葡萄糖含量[10]。細(xì)胞所消耗的葡萄糖量(GC)=無細(xì)胞對照組培養(yǎng)液中葡萄糖含量-各組細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量。

1.3.4 吡格列酮對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞細(xì)胞糖異生作用的影響 同樣復(fù)制上述胰島素抵抗模型之后換以Krebs-Ringer緩沖液,將細(xì)胞分為正常細(xì)胞對照組,模型組和吡格列酮組(濃度為10-5mol?L-1)加入10-5mol?L-1吡格列酮,再按是否加入生理濃度的胰島素(10-9mol?L-1)以及是否含有底物(終濃度為10 mmol?L-1的乳酸)將上述三組細(xì)胞各分一平行組,繼續(xù)孵育2h。孵育結(jié)束后,取上清測定葡萄糖含量;板中下層細(xì)胞用200g?L-1的KOH裂解,用考馬斯亮蘭法測定蛋白含量。糖異生量(μ mol?mg-1)=葡萄糖生成量(μ mol)/蛋白含量(mg)

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗各組同批內(nèi)重復(fù)6次,計量數(shù)值用表示。采用統(tǒng)計軟件SPSS17.0行統(tǒng)計學(xué)分析,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吡格列酮對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

在無生理濃度胰島素存在條件下,胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞組糖耗與對照組相比并無明顯差異;給予生理胰島素后,對照組和胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞組糖耗均增加,但后者明顯低于前者(0.85±0.03 vs 0.68±0.02,P＜0.05)。給予吡格列酮后,僅與細(xì)胞孵育12h即可顯著促進(jìn)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞組糖耗,與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義((0.6±0.01 vs 1.7±0.02,P＜0.05);加入生理胰島素時,吡格列酮表現(xiàn)出與胰島素協(xié)同的促進(jìn)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞糖耗的作用。(圖1)

2.2 吡格列酮對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞糖異生作用的影響

在無底物乳酸和胰島素存在條件下,吡格列酮對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞糖異生均沒有表現(xiàn)出明顯抑制作用。底物乳酸存在條件下,生理濃度胰島素可顯著抑制胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞糖異生作用;給予吡格列酮后,胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞的糖異生作用也受到明顯抑制,且吡格列酮與胰島素有協(xié)同抑制胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞糖異生的作用(表1)。

圖1 吡格列酮對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響(,n=6)

表1 吡格列酮對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞細(xì)胞糖異生作用的影響(,n=6)

表1 吡格列酮對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞細(xì)胞糖異生作用的影響(,n=6)

注：VS模型組+乳酸,△P＜0.05;VS模型組+乳酸+胰島素,▲P＜0.05

組別 糖異生量(umol?mg-1)對照組8.3±0.05模型組10.2±0.13吡格列酮組 9.0±0.03△對照組+乳酸 12.0±0.15模型組+乳酸 14.5±0.11吡格列酮組+乳酸 12.2±0.08△對照組+乳酸+胰島素 9.6±0.02模型組+乳酸+胰島素 13.5±0.04吡格列酮組+乳酸+胰島素 10.8±0.03▲

3 討論

胰島素抵抗是糖尿病、肥胖、冠心病、高血壓及脂代謝異常等多種疾病發(fā)病的中心環(huán)節(jié),IR的發(fā)病機(jī)理不明,研究其發(fā)生機(jī)制成為當(dāng)今的重要課題。胰島素抵抗可以發(fā)生在胰島素信號傳導(dǎo)和環(huán)境因素等各個環(huán)節(jié),我們采用地塞米松誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞構(gòu)建的胰島素抵抗模型,對胰島素抵抗前提下細(xì)胞水平糖代謝過程中葡萄糖消耗糖異生做了進(jìn)一步的研究,研究表明：吡格列酮可顯著改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1脂肪細(xì)胞的糖代謝作用,并且對糖代謝過程中糖異生有明顯的抑制作用,并且該抑制作用在胰島素存在的情況下表現(xiàn)的更明顯,其詳細(xì)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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