田雁鈺

(南陽市食品藥品檢驗所,河南 南陽 473061)

燈盞細(xì)辛注射液是中藥成方制劑,具有活血祛瘀,通絡(luò)止痛等功效。常用于瘀血阻滯,中風(fēng)偏癱,肢體麻木,口眼歪斜,言語謇澀,胸痹心痛,缺血性中風(fēng),冠心病心絞痛等上述癥候者。《中國藥典》2010年版一部[1]標(biāo)準(zhǔn)僅收載其熱原檢查法,操作繁瑣,干擾因素多。本文對燈盞細(xì)辛注射液采用凝膠法和動態(tài)濁度法測定其細(xì)菌內(nèi)毒素含量,驗證了燈盞細(xì)辛注射液進(jìn)行內(nèi)毒素定性檢查與定量檢測的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

燈盞細(xì)辛注射液,批號：20070136,20070816(云南生物谷燈盞花制藥有限公司);0703112,0705126(深圳市生物谷制藥藥業(yè)有限公司)。樣品均按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行熱原檢查,結(jié)果均符合規(guī)定。

定量用鱟試劑(標(biāo)示靈敏度 0.03EU?ml-1),批號：20070921,1.2ml?支-1(湛江博康海洋生物有限公司)。

凝膠用鱟試劑(TAL)標(biāo)示靈敏度(λ)0.5EU?ml-1,批號：0604201,(湛江博康海洋生物有限公司)。批號：0611092,(湛江安度斯生物有限公司)。均為0.1ml?支-1。

細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品,批號：981,9000EU?支-1(中國藥品生物制品檢定所);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(簡稱：BET水),批號2006012,規(guī)格：10ml?支-1,含細(xì)菌內(nèi)毒素＜0.003 EU?ml-1,(湛江博康海洋生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)的確定

按公式L=K?M-1,K為按規(guī)定的給藥途徑,人用每千克體重每小時可接受的最大內(nèi)毒素劑量,注射劑K=5EU?kg-1?h-1;M為人用每千克體重每小時可接受的最大藥品劑量,人均體重按60kg計算,注射時間按1h計算,燈盞細(xì)辛注射液的用法用量：靜脈注射,一次20～40ml,一日 1～2次。即成人的最大劑量為 80ml,故 L=5EU?kg-1?h-1/80ml×60kg?h-1,計算得 L=3.75EU?ml-1。為了更好控制其質(zhì)量,現(xiàn)將其細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為：L=3EU?ml-1。

1.2.2 鱟試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核

按《中國藥典》2010年版一部附錄“鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗”項下規(guī)定進(jìn)行,結(jié)果符合規(guī)定。

2 結(jié)果

2.1 供試品的干擾試驗及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查(凝膠法)

2.1.1 供試品的干擾預(yù)試驗 由于本品L為3EU?ml-1,采用靈敏度λ=0.5EU?ml-1,故最大有效稀釋倍數(shù)M VD=L?C?λ-1=25。取批號為20070136的供試品以BET水進(jìn)行5、20、25倍稀釋,記此稀釋液系列為陰性(NPC)。另在上述稀釋過程中加入標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素,使每一稀釋度的稀釋液都含有2λ濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素,記此稀釋系列為陽性(PPC),進(jìn)行干擾試驗,結(jié)果見表1。

表1 供試品干擾預(yù)試驗結(jié)果(凝膠法)

2.1.2 干擾試驗 由干擾預(yù)試驗結(jié)果可知,將供試品稀釋25倍,對λ為 0.5EU?ml-1的鱟試劑檢查無干擾。分別取3批供試品,按《中國藥典》2010年版一部進(jìn)行正式干擾試驗,結(jié)果見表2。由此可見,ES與 Et均在0.5λ～ 2.0λ(即0.25～ 1.0)之間,說明供試品在該濃度下不干擾試驗。

表2 供試品干擾試驗結(jié)果(凝膠法)

2.1.3 供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的常規(guī)檢查

將4批熱原檢查合格的燈盞細(xì)辛注射液用BET水稀釋25倍,選用上述兩種鱟試劑,依法檢查細(xì)菌內(nèi)毒素,結(jié)果供試品管和陰性對照管均顯陰性,供試品陽性管和陽性對照管均顯陽性,4批燈盞細(xì)辛注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合規(guī)定。

2.2 供試品的干擾試驗和細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(動態(tài)濁度法)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及可靠性

用BET水將內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍稀釋,使其濃度分別為10、1、0.1、0.01 EU ?ml-1,各取 0.2ml分別加入 0.1ml定量用鱟試劑于反應(yīng)管中,混合均勻,插入儀器進(jìn)行檢測,每一濃度平行做4支,同時做陰性對照,檢測結(jié)果見表3.

回歸方程為：log T=2.852-0.2374logC r=0.9936該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.01～10.0 EU?ml-1,由于陰性對照反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度反應(yīng)時間,故該標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及可靠性(n=4)

2.2.2 最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)計算

按公式MVD=LC/λ,其中λ=0.03 EU?ml-1,L=3 EU?mg-1,C=4.5mg?ml-1,計算得MVD為450。

2.2.3 干擾預(yù)試驗

將供試品用BET依次稀釋為 50、100、200、400倍,記為 A液;另取A液配制成含內(nèi)毒素為0.5 EU?ml-1的同樣稀釋倍數(shù)的供試品陽性管,記為B液;用BET水溶解定量用鱟試劑,混勻,取0.1ml分裝至反應(yīng)管;取A液,B液各0.2ml分別加入裝有0.1ml定量用鱟試劑的反應(yīng)管中,其中每個濃度2支,計算平均回收率,回收率(%)=[(B液內(nèi)毒素濃度-A液內(nèi)毒素濃度)/添加內(nèi)毒素濃度]×100%,結(jié)果見表4。由表4結(jié)果可知,燈盞細(xì)辛注射液的100、200、400倍稀釋液外加內(nèi)毒素回收率均在有效范圍50%～200%內(nèi),表明供試品在該試驗條件下能排除干擾因素,正式干擾試驗選用200倍稀釋液。

表4 供試品干擾預(yù)試驗結(jié)果(動態(tài)濁度法)

2.2.4 正式干擾試驗[2]

將4批燈盞細(xì)辛注射液用BET水稀釋至200倍,按上述干擾試驗方法定量檢測,計算注射液中內(nèi)毒素含量和外加內(nèi)毒素平均回收率,結(jié)果見表5,其中標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

logT=2.852-0.2374logC r=0.9936由表5結(jié)果發(fā)現(xiàn),4批燈盞細(xì)辛注射液200倍稀釋液外加內(nèi)毒素回收率均在50%～200%內(nèi),表明日常檢測其內(nèi)毒素含量可用200倍稀釋液。

表5 供試品正式干擾試驗結(jié)果(動態(tài)濁度法)(n=4)

2.2.5 定量檢測

定量檢測供試品和操作同上述正式干擾試驗,4批供試品細(xì)菌內(nèi)毒素含量均小于0.5 EU?mg-1,結(jié)果符合規(guī)定(見表5)。

3 討論

本文采用兩種方法測定燈盞細(xì)辛注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素含量,其結(jié)果與與熱原檢查結(jié)果一致,且動態(tài)濁度法比凝膠法快捷,靈敏,更真實反映藥品質(zhì)量。結(jié)果證實燈盞細(xì)辛注射液稀釋25倍(凝膠法)和200倍(動態(tài)濁度法)后對鱟試劑及內(nèi)毒素反應(yīng)無干擾作用。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法操作簡單,準(zhǔn)確度高,重現(xiàn)性好,故采用細(xì)菌內(nèi)毒素定性檢查與定量檢測方法代替熱原檢查法進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控合理,可行。

1 中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010：707.

2 邱文煒,詹云麗,劉一波,等.動態(tài)濁度法定量檢測魚腥草注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報,2004,20(6)：621-622.