周瑋蘆珊楊剛

我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［1］，結(jié)直腸癌的治療仍以手術(shù)治療為主［2］，但仍有40%以上的患者5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。目前推測(cè)預(yù)后的主要可靠依據(jù)為常規(guī)病理和臨床分期等，但用現(xiàn)代分子生物學(xué)理論來判斷腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性，以補(bǔ)充病理和臨床分期的不足，更精確地判斷患者的預(yù)后是一非常有意義的課題［3］。

細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)是機(jī)體細(xì)胞免疫中重要的效應(yīng)細(xì)胞，參與機(jī)體抗腫瘤作用，近來，人們又認(rèn)識(shí)到CD4(+)T細(xì)胞在機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)中的重要作用。CTL以表達(dá)CD8(+)的T淋巴細(xì)胞為主，大腸癌中有CD8(+)T淋巴細(xì)胞的局部浸潤(rùn)者生存時(shí)間提高［4，8］。另外結(jié)直腸癌有微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)的表達(dá)［5］，有研究表明MSI(+)者預(yù)后好于MSI(－)者，且有癌腫較大、低分化等病理特點(diǎn)［6，7］，而此兩項(xiàng)特點(diǎn)卻與常規(guī)病理預(yù)后指標(biāo)相矛盾。有研究認(rèn)為MSI(+)結(jié)腸癌有癌腫內(nèi)T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，因此預(yù)后較好［8］，為此我們檢測(cè)了SCRC組織中CD4、CD8和MSI表達(dá)及與其預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本材料

標(biāo)本取自南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院1999年1月至2000年3月手術(shù)切除的SCRC標(biāo)本，共50例(經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)同意)。全部患者按阿姆斯特丹標(biāo)準(zhǔn)排除遺傳性結(jié)、直腸癌，符合SCRC標(biāo)準(zhǔn);其中男性23例，女性27例，年齡29～81歲，平均年齡49.6歲。術(shù)前未經(jīng)任何抗癌治療，均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。按pTNM病理學(xué)分期，Ⅰ期0例，Ⅱ期13例，Ⅲ期26例，Ⅳ期11例。其中區(qū)域淋巴結(jié)陽性37例，陰性者13例。癌旁組織為上述20例SCRC組織的陰性切緣組織。從原病歷中獲得癌細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌浸潤(rùn)深度、腫瘤大小等臨床病理資料。同時(shí)根據(jù)上述資料按新版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)重新進(jìn)行TNM分期。

1.2 主要試劑

MAB-0021鼠抗人CD8單克隆抗體、即用型克隆系 C8/144B、Rev 021602鼠抗人CD4單克隆抗體、即用型克隆系4B12、封閉用正常山羊血清工作液、生物素標(biāo)記二抗工作液和過氧化酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液均為福州邁新公司產(chǎn)品。2×Taq PCR Master Mix為北京天為時(shí)代科技有限公司產(chǎn)品。DNA Marker為北京天為時(shí)代公司產(chǎn)品。胰酶、DAB(Dialminobenzdine)顯色液、蛋白激酶K為美國(guó)Dako公司產(chǎn)品?；蚪MDNA提取試劑盒DP－303/304為北京天為時(shí)代科技有限公司產(chǎn)品。引物 BAT25、BAT26、D5S346、D17S261、D2S123為北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

SP(streptavidin-peroxindase)法即過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素染色法［12］。以0.01 mmol/L PBS緩沖液取代一抗作陰性對(duì)照，用已知陽性切片作為陽性對(duì)照。免疫組化步驟按說明書進(jìn)行操作。

1.4 DNA 提取

在10μm厚的石蠟切片上采用顯微微切技術(shù)獲得腫瘤組織，并進(jìn)行脫蠟處理，將組織打碎處理為細(xì)胞懸液，然后10 000 rpm離心1 min，倒盡上清，加200μl緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮，然后按產(chǎn)品說明書操作，得到的基因組DNA在OD260處有顯著吸收峰。

1.5 PCR 步驟

各取cDNA產(chǎn)物2μl，待測(cè)凋亡相關(guān)基因和β-actin的正、反義引物各1μl(10μmol/L)，2×Taq-Mix 12.5 μl，加 ddH2O 6.5 μl，總反應(yīng)體積 25 μl。反應(yīng)條件:94℃ 3 min，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，38 個(gè)循環(huán);結(jié)束前72℃延伸10 min。

1.6 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

CD4和CD8主要表達(dá)于癌細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)，為棕褐色顆粒。免疫組織化學(xué)染色切片在光鏡下計(jì)數(shù)。每張切片首先在100倍光鏡下觀察10個(gè)以上獨(dú)立視野，選取5個(gè)陽性細(xì)胞數(shù)最多的視野，然后換成400倍的光鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)，取5個(gè)視野計(jì)數(shù)的平均數(shù)。按文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)［8］，在400倍光鏡下CD4細(xì)胞陽性數(shù)＞40個(gè)定為CD4(+)，其余均為CD4(－);CD8細(xì)胞陽性數(shù) ＞80個(gè)者定為CD8(+)，其余則定為CD8(－)。參與計(jì)數(shù)的病理科醫(yī)師對(duì)患者的臨床等其它相關(guān)信息不知。

MSI結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)按美國(guó)國(guó)立癌癥研究所制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行:5個(gè)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記中若有2個(gè)或2個(gè)以上出現(xiàn)MSI現(xiàn)象為MSI(+)，若僅有1個(gè)出現(xiàn)MSI現(xiàn)象為MSI(－)，如無出現(xiàn)MSI現(xiàn)象為MSS。由于MSI(－)和MSS的臨床特征相似，故本研究將此兩類合并為一組統(tǒng)計(jì)。

1.7 隨訪

采用電話隨訪及來院復(fù)診相結(jié)合方式，登記目前狀況、死亡時(shí)間、直接死亡原因、復(fù)發(fā)時(shí)間，計(jì)算無病生存期、累積生存率等。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用卡方檢驗(yàn)分析組間差異，應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)分析相關(guān)性。采用Log Rank法比較存活率間的差異，同時(shí)采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 SCRC、癌旁組織中CD4和CD8的表達(dá)情況

CD4、CD8陽性染色位于癌細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)，癌旁組織切片中均無陽性染色。50例SCRC組織中CD4和CD8表達(dá)率均較相應(yīng)的癌旁組織高，差異有顯著意義(P ＜0.05)，見表1。

表1 SCRC和癌旁組織中CD4和CD8的表達(dá)情況(例，%)

2.2 CD4和CD8表達(dá)與術(shù)后生存率的關(guān)系

本組50例SCRC患者術(shù)后5年生存率為48%。按CD4和CD8表達(dá)強(qiáng)弱分組，CD4(+)和CD8(+)組術(shù)后5年生存率均高于CD4(－)和CD8(－)組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。若將標(biāo)本分成CD4/8(+/+)［CD4/8(+)］、CD4/8(+/－ )、CD4/8(－ /+)、CD4/8(－/－)四組，為統(tǒng)計(jì)方便將 CD4/8(+/+)表示為CD4/8(+)，將CD4/8(+)以外的CD4/8各種表達(dá)組合均統(tǒng)表示為CD4/8(－)。則CD4/8(+)組的5年累積生存率高于其余三組之和［即CD4/8(－)］，差異有顯著性(P ＜0.01)，見表2。

2.3 CD4、CD8表達(dá)與SCRC臨床病理特征的關(guān)系

有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期與CD4/8(+/+)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，見表2。

2.4 SCRC 組織中 CD4、CD8表達(dá)與 MSI(+)的關(guān)系

本組50例 SCRC中MSI(+)者12例(24.0%)。CD4/8(+)表達(dá)中有62.5%為 MSI(+)，而 MSI(－)組中僅占 25.0%，差異有顯著性(P＜0.01)。經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，SCRC組織中CD4/8(+)表達(dá)與MSI(+)呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，而與MSI(－)無相關(guān)性(P ＞0.05)，見表3。

表2 CD4/8表達(dá)與SCRC臨床病理特征的關(guān)系(例)

表3 MSI與CD4 CD8表達(dá)的關(guān)系(例)

3 討論

3.1 SCRC組織中的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞

腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumou-infiltrating lymphycyte，TIL)是一類由不同細(xì)胞構(gòu)成的異質(zhì)細(xì)胞群。腫瘤原發(fā)灶局部免疫細(xì)胞是防止腫瘤生長(zhǎng)、發(fā)展的第一道防線。TIL可浸入腫瘤組織中，其抗腫瘤作用比循環(huán)淋巴細(xì)胞更直接，更準(zhǔn)確地反映宿主－腫瘤相互作用的免疫應(yīng)答狀態(tài)。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)是機(jī)體TIL細(xì)胞免疫中重要的效應(yīng)細(xì)胞之一，CTL主要是表CD8T淋巴細(xì)胞，其主要功能是特異性殺傷靶細(xì)胞。腫瘤中CD8T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)是有助于延長(zhǎng)患者生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)［9］，有研究認(rèn)為成熟的T淋巴細(xì)胞除CD8T亞群外，還有CD4T淋巴細(xì)胞亞群，過去僅注意CD8T的抗瘤作用，近來開始逐漸認(rèn)識(shí)到CD4T淋巴細(xì)胞在機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)中的作用。有研究認(rèn)為，CD8T細(xì)胞在CD4T細(xì)胞本身和其分泌的大量細(xì)胞因子輔助作用下殺傷腫瘤細(xì)胞，缺乏CD4T淋巴細(xì)胞是抗腫瘤免疫效應(yīng)低下的原因［10，11］。本研究顯示 SCRC 中 CD4、CD8表達(dá)水平均高于正常組織，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然單獨(dú)CD4T(+)組或CD8T(+)組與相應(yīng)的陰性組相比累計(jì)生存時(shí)間均更長(zhǎng)，但其5年累積生存率差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但若將CD4(+)、CD8(+)合并成為CD4/8(+)，而CD4/8(+/+)以外的CD4/8各種表達(dá)組合均統(tǒng)歸為CD4/8(－)加以統(tǒng)計(jì)，則CD4/8(+)組的5年累積生存率高于CD4/8(－)，差異具有顯著性。這提示CD4T可促進(jìn)CD8T的抗癌效應(yīng)。因而，對(duì)CD4T和CD8T細(xì)胞抗癌機(jī)制的深入研究對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后判定有一定的價(jià)值。

3.2 CD4、CD8表達(dá)與 MSI的關(guān)系

本組MSI(+)表達(dá)率為24%，與先前文獻(xiàn)報(bào)道相比稍高［12］，先前研究認(rèn)為MSI(+)的結(jié)直腸癌預(yù)后較好，5年累積生存率高于MSI(－)。而MSI(+)的癌細(xì)胞組織分化低者較MSI(－)多見，此點(diǎn)與常規(guī)病理的預(yù)后相矛盾。目前對(duì)MSI(+)預(yù)后較好的原因尚不清楚，有學(xué)者認(rèn)為與MSI(+)腫瘤突變負(fù)擔(dān)增加最終削弱了其生長(zhǎng)能力及轉(zhuǎn)移潛能，另有學(xué)者認(rèn)為與MSI(+)腫瘤引起機(jī)體更強(qiáng)的免疫反應(yīng)有關(guān)［13］。然而，MSI(+)腫瘤局部是否有免疫細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象的不同還未見研究報(bào)道?本研究發(fā)現(xiàn)CD4/8(+)表達(dá)占MSI(+)組的62.5%，而在 MSI(－)組中僅占 25.0%，經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，SCRC組織中CD4/8(+)表達(dá)與MSI(+)具有相關(guān)關(guān)系，與MSI(－)不具有相關(guān)性。這提示MSI(+)的SCRC患者的預(yù)后較好的原因可能與癌腫局部的CTL免疫反應(yīng)有關(guān);從MSI(+)表型產(chǎn)生機(jī)制角度解釋，由錯(cuò)配修復(fù)基因突變引起的MSI(+)組織中有大量的突變蛋白聚集，這些突變蛋白可作為外來抗原刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)并參與抗腫瘤效應(yīng)［13］。這也為腫瘤組織局部淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的產(chǎn)生機(jī)制提供合理解釋。進(jìn)一步研究MSI(+)中CD4T和CD8T產(chǎn)生的具體機(jī)制，如CD4T或CD8T是由哪個(gè)或哪幾個(gè)框移突變肽誘導(dǎo)而來的，從而作為SCRC免疫性靶抗原治療提供理論基礎(chǔ)。

3.3 MSI、CD4、CD8 與 TNM 分期的關(guān)系

TNM分期是目前主要臨床分期方法，但在預(yù)后判斷上也存在一些矛盾現(xiàn)象，應(yīng)用分子生物學(xué)等方法來估計(jì)腫瘤的惡性程度，以補(bǔ)充TNM分期的某些不足，更準(zhǔn)確地判斷預(yù)后，為進(jìn)一步積極輔助治療提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，MSI表達(dá)與TNM分期無相關(guān)性，而CD4/8(+)與TNM分期有相關(guān)性。進(jìn)一步對(duì)同一TNM分期患者生存差異分析發(fā)現(xiàn)，13例TNMⅡ期患者中7例存活超過5年，另外6例少于5年，其CD4/8(+)的表達(dá)率分別為57.1%和33.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。26例TNMⅢ期患者中9例存活超過5年，另外17例少于5年，其 CD4/8(+)表達(dá)率分別為 66.7%和23.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此現(xiàn)象可能是目前臨床上常見的TNMⅢ期預(yù)后較TNMⅡ期好的原因所在，即MSI(+)導(dǎo)致抗腫瘤效應(yīng)的CD4/8T細(xì)胞局部反應(yīng)。

因而，本研究認(rèn)為CD4/8(+)檢測(cè)可補(bǔ)充TNM分期的不足，特別是MSI(+)者，用于判斷預(yù)后，或者說可對(duì)TNM分期進(jìn)一步細(xì)化，聯(lián)合TNM分期和CD4/8、MSI可更準(zhǔn)確的判斷患者的預(yù)后，從而為隨后的綜合治療的制訂提供更準(zhǔn)確的治療方案。

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