余玉紅 陳出新 張 嘉

大腸腺瘤(colorectal adenoma)是大腸癌(colorectal carcinoma)的癌前期病變，80%以上的大腸癌由腺瘤惡變而來。從大腸腺瘤到癌的演變是由多基因參與的多階段、多步驟改變并積累的復(fù)雜過程。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)是一組具有調(diào)節(jié)細胞生長和分化功能的多肽類細胞因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。目前認為，TGF-βl具有雙向作用:在腫瘤發(fā)生早期，抑制腫瘤細胞的生長;但在腫瘤的中后期，TGF-βl在腫瘤細胞中的高表達，可能促進腫瘤的惡性特征。TGF-βl基因具有多態(tài)性，其第25位氨基酸密碼子+915G/C多態(tài)性位于TGF-βl的信號肽區(qū)，與血清TGF-β1的濃度顯著相關(guān)［1］。鑒于TGF-βl在腫瘤免疫調(diào)節(jié)中的重要作用，我們把TGF-βl基因作為大腸腺瘤和大腸癌的易感候選基因來研究。本研究探討TGF-β1基因+915位點G/C多態(tài)性與大腸腺瘤及大腸癌易感性的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

病例組:52例散發(fā)型大腸腺瘤病例及70例散發(fā)型大腸癌病例來自深圳市各級醫(yī)院2007年1月～2009年8月經(jīng)組織病理學(xué)確診的住院患者，其中大腸癌病例采血時未行放射和化學(xué)治療，分期標準采用Dukes改良分期。大腸腺瘤組男性28例，女性24例，平均發(fā)病年齡(43±12)歲。大腸癌組男性41例，女性29例，平均發(fā)病年齡(49±11)歲;其中結(jié)腸癌26例，直腸癌44例;組織學(xué)分型腺癌65例，黏液腺癌5例;Dukes分期A期14例，B期19例，C期20例，D期17例。對照組102例，來自深圳市第七人民醫(yī)院的健康體檢者，其中男性66例，女性36例，平均年齡(44±17)歲。以上研究對象均為無血緣關(guān)系的漢族人。該研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 基因分型

用蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和乙醇沉淀的方法分離基因組DNA。按照Amani等［2］方法，從基因組DNA中擴增包含+915位點多態(tài)性的TGF-β1基因片段。據(jù)文獻上游引物序列為5’GCTGCTACCGCTGCTGTGGC 3’，下 游 引 物 序 列 為 5’TGTTGTACAGGGCGAGCACGG 3’，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)總體積25μl，其中含滅菌雙蒸水18.5 μl，10×PCR 反應(yīng)緩沖液2.5 μl，上下游引物(10 μmol/L)各 1 μl，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μl，TaqDNA聚合酶0.5 μl，模板 DNA 1 μl(約30 ～100 ng)。PCR反應(yīng)在GeneAmp 2 400 PCR儀(Perkin Elmer公司)上進行。反應(yīng)條件94℃變性5 min后，94℃ 40 s，57℃ 1 min，72℃ 1 min，30 個循環(huán)，最后 72℃延伸 5 min。擴增的DNA片段經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察鑒定。限制性內(nèi)切酶BglI(購自MBI)消化PCR產(chǎn)物。反應(yīng)體系:PCR 產(chǎn)物10 μl，滅菌雙蒸水7.5 μl，10×限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液2.0μl，與5 U限制性內(nèi)切酶BglI，于37℃水浴5 h，65℃加熱10 min終止反應(yīng)，用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析基因型。

1.3 血清TGF-βl水平的檢測

用ELISA法測定血清TGF-β1水平。采用人TGF-β1測定ELISA試劑盒(美國R＆D公司產(chǎn)品，從深圳晶美生物工程有限公司購買)，收集血液，將血清凍存于－20℃的低溫冰箱。具體操作步驟如下:分別加入標準品及樣品各100μL，辣根過氧化物酶結(jié)合的TGF-β1 50μL，室溫孵育2 h，棄上清液，再加入顯色劑100 μL，室溫孵育30 min終止反應(yīng)。酶標儀讀取A值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

以Hardy-Weinberg平衡檢驗確認研究樣本的群體代表性，計算各組的基因型頻率及等位基因頻率。以χ2檢驗分析病例組和對照組TGF-β1基因型及等位基因分布的差異。以優(yōu)勢比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(CI)表示相對風(fēng)險度。P＜0.05認為有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。計量資料以均數(shù)±標準差±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05認為有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計在SPSS 11.5軟件包中進行。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1 基因型檢測結(jié)果

擴增的PCR產(chǎn)物約215 bp，用限制性內(nèi)切酶BglI消化后，TGF-β1+915位點基因多態(tài)性共檢測到3種基因型，分別為 GG(175 bp和40 bp)、GC(215 bp、175 bp和40 bp)、CC(215 bp)，見圖1。其中40 bp片段較小，已移出膠外。經(jīng)χ2檢驗，大腸腺瘤組，大腸癌組和正常對照組人群基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡。

圖1 TGF－β1擴增產(chǎn)物被BglI酶切后的電泳結(jié)果

2.2 TGF-β1+915位點基因多態(tài)性比較

我們比較了大腸腺瘤組，大腸癌組和正常對照組TGF-β1+915位點基因多態(tài)性分布，發(fā)現(xiàn)TGF-β1+915位點基因型頻率和等位基因頻率在各群體的總體分布無顯著差異(P＞0.05)，見表1。

表1 病例組和對照組TGF-β1基因+915位點G/C多態(tài)性分布

2.3 TGF-β1+915位點多態(tài)性與大腸腺瘤病變部位的關(guān)系

按病變部位將大腸腺瘤分為結(jié)腸腺瘤和直腸腺瘤后，未發(fā)現(xiàn)TGF-β1+915位點基因型頻率和等位基因頻率分布的差異(P＞0.05)，見表2。

表2 TGF-β1基因+915位點G/C多態(tài)性與大腸腺瘤病變部位的關(guān)系

2.4 TGF-β1+915位點多態(tài)性與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系

大腸癌病例分別按病變部位、分化程度、Dukes分期等臨床病理特征分層后，未見TGF-β1+915位點基因型及等位基因頻率分布存在顯著性差異(P＞0.05)，見表3。在此基礎(chǔ)上我們進一步分析比較了不同性別的大腸癌患者TGF-β1基因型在以上幾種臨床病理特征中的分布，均未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P＞0.05)。

表3 TGF-β1基因+915位點G/C多態(tài)性與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.5 病例組和對照組TGF-β1血清水平的比較

與對照組比較，大腸腺瘤和大腸癌組血清TGF-β1水平顯著增高(分別 t=2.739，P ＜ 0.01;t=9.805，P＜0.01)，且大腸癌組血清TGF-β1水平顯著高于大腸腺瘤組(t=4.285，P ＜0.01)。Dukes D 期 TGF-β1 血清水平顯著高于Dukes A期(分別為 t=2.661，P=0.029)及 Dukes B 期(t=2.988，P=0.017)。見表4。

表4 病例組和對照組TGF-β1血清水平比較

2.6 病例組各基因型間TGF-β1血清水平的比較

大腸腺瘤組和大腸癌組TGF-β1+915位點各基因型間TGF-β1血清水平無顯著型差異(P＞0.05)，見表5。

表5 病例組不同基因型間TGF-β1血清水平比較

3 討論

人類編碼TGF-βl的基因位于染色體19q13.1-3，其編碼區(qū)域由7個外顯子和6個內(nèi)含子構(gòu)成。目前發(fā)現(xiàn)TGF-βl基因至少存在9個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點，它們的定位分別是-988(C＞A)、-800(G＞A)、-509(C＞T)、+72插入C、第4個內(nèi)含子缺失c、第5個內(nèi)含子內(nèi)(C861-20T)、第10位氨基酸密碼子T869C(CTG ＞CCG，Leu＞Pro)、第 25位氨基酸密碼子G915C(CGG＞CCG，Arg＞Pro)、第263位氨基酸密碼子C1632T(ACC＞ATC，Thr＞Ile)。其中已有文獻報道［1，3，4］啟動子區(qū)-509(C ＞ T)、第 1 外顯子區(qū)第 10 氨基酸密碼子T869C(Leu＞Pro)、第25氨基酸密碼子G915C(Arg＞Pro)多態(tài)性的某些基因型與TGF-β1水平增高有關(guān)。

第25位氨基酸密碼子G915C多態(tài)性(rs1800471)位點位于第1個外顯子編碼的TGF-β1的信號肽區(qū)，信號肽序列的改變可能影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進而影響TGF-β1相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。Garcia-Gonzalez等［5］在142例西班牙胃癌患者中，未發(fā)現(xiàn)TGF-β1 G915C基因多態(tài)性與胃癌之間的相關(guān)性。Berndt等［6］對美國人的研究發(fā)現(xiàn)，－509TT和10Pro/Pro基因型與大腸腺瘤的高風(fēng)險相關(guān)。其中－509TT基因型與多發(fā)性腺瘤及直腸腺瘤相關(guān)，而第25氨基酸密碼子G915C(Arg＞Pro)和第5外顯子區(qū)的第263氨基酸密碼子C1632T(Thr＞Ile)多態(tài)性與大腸腺瘤無關(guān)。我們采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法檢測了52例大腸腺瘤、70例大腸癌患者與102例正常對照者TGF-β1+915位點等位基因及基因型，總體分布未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。與國外研究相似，表明TGF-β1+915G/C基因多態(tài)性與患大腸腺瘤及大腸癌的風(fēng)險無關(guān)。

TGF-β1具有雙向作用:在腫瘤發(fā)生早期，TGF-β1起抑制作用，在腫瘤發(fā)生的后期TGF-β1則作為促癌因子直接作用于腫瘤細胞，通過刺激血管生成、增加瘤細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用以及抑制免疫系統(tǒng)等促進腫瘤的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移［7］。大腸癌患者中TGF-β1血清水平增加且與腫瘤的分期或外科手術(shù)切除后的轉(zhuǎn)移相關(guān)［6］。我們分析比較了TGF-β1不同基因型的大腸癌患者臨床病理特征。不同性別、不同的病變部位、分化程度、Dukes分期等臨床病理特征中TGF-β1基因型及等位基因頻率分布無顯著性差異。表明+915G/C基因多態(tài)性可能與大腸癌的進展無關(guān)。我們同時采用ELISA法檢測了血清TGF-β1水平，發(fā)現(xiàn)大腸腺瘤組及大腸癌組血清TGF-β1水平顯著高于對照組。Dukes D期血清TGF-β1水平顯著高于Dukes A期(分別為 t=2.661，P=0.029)及 Dukes B 期(t=2.988，P=0.017)。可能的假說為:在腫瘤后期個體產(chǎn)生TGF-β1水平增高，從而促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。我們進一步比較了TGF-β1+915位點各基因型間TGF-β1血清水平，未發(fā)現(xiàn)顯著型差異。表明TGF-β1血清水平可能與+915位點基因型無關(guān)。

我們檢測的樣本例數(shù)較少，尚需進一步擴大樣本檢測量，并完善TGF-β1其他多態(tài)性位點的檢測，從而明確TGF-β1基因型與TGF-β1分子表達的關(guān)系。

［1］ Tag CG，Mengsteab S，Hellerbrand C，et al.Analysis of the transforming growth factor-beta1(TGF-beta1)codon 25 gene polymorphism by Light Cycler-analysis in patients with chronic hepatitis C infection〔J〕.Cytokine，2003，24(5):173.

［2］ Amani D，Dehaghani AS，Zolghadri J，et al.Lack of association between the TGF-β1 gene polymorphisms and recurrent spintaneous abortion〔J〕.JReprod Immunol，2005，68(1 ～2):91.

［3］ Eliopoulos DG，Mavroudi I，Pontikoglou C，et al.The-509C/T polymorphism of transforming growth factor-beta1 is associated with increased risk for developmentof chronic idiopathic neutropenia〔J〕.Eur JHaematol，2009，83(6):535.

［4］ Brezzi B，Del Prete D，Lupo A，et al.Primary IgA nephropathy ismore severe in TGF-beta1 high secretor patients〔J〕.J Nephrol，2009，22(6):747.

［5］ Garcia-Gonzalez MA，Strunk M，Piazuelo E，et al.TGFB1 gene polymorphisms:their relevance in the susceptibility to Helicobacter pylori-related diseases〔J〕.Genes Immun，2006，7(8):640.

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