駱梅青 李錫清

鼻咽癌是我國常見的惡性腫瘤之一，早期即可發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移。血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF－C)和血管內(nèi)皮生長因子受體 3(vascular endothelial growth factor receptor3，VEGFR－3)［1］是與淋巴管生成及腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移有關(guān)的因子。本實驗通過對61例鼻咽癌的 VEGF－C和VEGFR－3進行免疫組織化學染色，觀察兩者在人鼻咽癌組織中的表達及其在淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用，以探討鼻咽癌的淋巴道轉(zhuǎn)移機制。

1 材料與方法

1.1 標本來源

所有組織標本均取自我院病理科2003年6月至2006年6月鼻咽鏡下活檢的鼻咽癌標本61例。所有標本活檢后均經(jīng)生理鹽水沖洗，多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚連續(xù)切片。所有標本結(jié)果均經(jīng)過常規(guī)病理檢查確診。

1.2 實驗試劑

兔抗人VEGF－C多克隆抗體、兔抗人VEGFR－3多克隆抗體和兔抗人D2－40單克隆抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司，PV－9000二步法免疫組織化學試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3 組織化學染色方法

免疫組織化學染色方法均參照 PV－9000二步法試劑盒的說明書進行，4μm連續(xù)切片、脫蠟入水，3%甲醇過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加鼠抗人單克隆抗體 D2－40及兔抗人 VEGF－C 及 VEGFR－3多克隆抗體，4℃冰箱孵育盒內(nèi)過夜。滴加聚合物輔助劑，37℃溫箱孵育30 min，滴加辣根酶標記羊抗兔/小鼠IgG多聚體，37℃溫箱孵育40 min，各步驟間均以PBS沖洗3次。DAB顯色，蒸餾水及時終止。蘇木精復染，脫水，中性樹膠封片，光鏡下觀察。每次實驗均以PBS代替一抗做陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

免疫組化結(jié)果判定:VEGF－C、VEGFR－3陽性反應均為棕黃色顆粒，定位于細胞質(zhì)和細胞膜。按細胞陽性著色程度，分弱陽性(+)為1分，中等陽性(++)為2分，強陽性(+++)為3分;依據(jù)陽性細胞數(shù)量分為弱陽性(+，陽性細胞數(shù)＜25%)為1分，中等陽性(++，指陽性細胞數(shù)在25% ～49%)為2分，強陽性(+++，指陽性細胞數(shù)在50%以上)為3分。計算方法為兩者相乘，＜3分為陰性，3～6分為陽性，＞6分為強陽性。HPF至少隨機觀察5～10個，取其平均值。微淋巴管計數(shù)方法參照 Weidner［2］計數(shù)標準，在低倍鏡下，選取腫瘤淋巴管最豐富的區(qū)域，然后在200倍視野范圍計算3個視野的微淋巴管的數(shù)目，取其平均值(均數(shù)±標準差)作為LVD。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。統(tǒng)計方法采用χ2檢驗和Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 VEGF－C、VEGFR－3 免疫組化染色結(jié)果

VEGF－C主要表達于癌細胞的胞質(zhì)，在腫瘤組織的間質(zhì)中可見少量表達，另外在癌組織的血管和淋巴管內(nèi)皮內(nèi)也可見VEGF－C的陽性表達。

VEGFR－3主要表達于由單層內(nèi)皮細胞構(gòu)成、管壁較薄、外周無周細胞、無平滑肌的脈管，管腔內(nèi)無紅細胞，有的管腔內(nèi)可見絮狀物。少數(shù)陽性表達的脈管管壁較厚，可見肌層。另外在正常黏膜的間質(zhì)內(nèi)也可見少量表達。VEGFR－3標記的微淋巴管主要存在于鼻咽癌癌周間質(zhì)和邊緣組織中，而腫瘤內(nèi)部一般較少微淋巴管，鼻咽癌組LVD明顯高于鼻咽正常組。

2.2 鼻咽癌組織中的LVD

癌組織周邊區(qū)淋巴管較為密集，而在腫瘤內(nèi)部，淋巴管主要分布于黏膜下層內(nèi)，淋巴管較為稀疏。61例鼻咽癌組織LVD均值為(8.12+2.44)，腫瘤內(nèi)部LVD均值為(6.32+1.62)，腫瘤邊緣區(qū) LVD(10.40+3.06)明顯高于腫瘤內(nèi)部的 LVD，P ＜0.05。

2.3 VEGF－C、VEGFR－3 表達與 LVD 的關(guān)系

VEGF－C、VEGFR－3 的表達情況與 LVD 的表達存在相關(guān)性，VEGF－C或 VEGFR－3陽性，則 LVD的值較大，且經(jīng)統(tǒng)計有顯著性差異，見表1。

表1 VEGF－C、VEGFR－3表達和LVD的關(guān)系±s)

表1 VEGF－C、VEGFR－3表達和LVD的關(guān)系±s)

因素 例數(shù) LVD P值VEGF－C+42 10.45+4.99－19 7.01+2.99 P ＜0.05 VEGFR－3+39 11.69+4.58－22 6.68+2.53 P＜0.05

2.4 VEGF－C表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

VEGF－C的表達率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與年齡、性別、T分期無關(guān)，見表2。

表2 VEGF－C表達與鼻咽癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

3.1 鼻咽癌組織中VEGF－C和VEGFR－3的表達

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族在最近幾年的腫瘤血管和淋巴管研究中日益受到重視。其中 VEGF－C被認為是與癌的淋巴道轉(zhuǎn)移有關(guān)的因子。VEGF－C的受體包括 VEGFR－2和 VEGFR－3。此前的研究表明，VEGF－C通過與VEGFR－2結(jié)合促進血管的生成，通過與 VEGFR－3 的結(jié)合促進淋巴管的生成［3～5］。VEGF－C在人體的多種組織中都有表達。李慧文等［6］對VEGFC和其受體VEGFR－3在舌癌組織中的表達以及與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移的關(guān)系方面進行了研究，結(jié)果證明VEGF－C在舌癌組織中的表達明顯增高，與癌的淋巴道轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并且 VEGFR－3和VEGF－C的表達顯著相關(guān)。楊艷等［7］報道VEGF、VEGF－C 表達與喉鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者年齡、性別、病變部位、T分期、病理分級無關(guān)，但對于VEGFR－3的表達未做研究。本實驗對61例鼻咽癌組織進行了免疫組化染色，結(jié)果顯示VEGF－C在鼻咽癌周邊組織中的表達明顯高于腫瘤組織內(nèi)。VEGFR－3的免疫組化染色結(jié)果顯示，VEGFR－3廣泛表達于多種組織，但主要表達于淋巴管。國內(nèi)相關(guān)研究的報道，證實VEGFR－3在口腔頭頸腫瘤有表達，且這種表達與腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移以及預后有關(guān)［8］。本實驗的研究顯示，隨著癌的發(fā)生以及癌的進展，VEGF－C和VEGFR－3的表達均逐漸增高，它們有可能共同對癌的侵襲和轉(zhuǎn)移起到了促進作用。

3.2 鼻咽癌組織中的LVD

自從Folkman在1970年首次提出腫瘤生長的血管依賴性假說以來，癌的血道轉(zhuǎn)移一直是腫瘤研究的熱點問題［9］，而在最近幾年癌的淋巴道轉(zhuǎn)移問題越來越受到人們的重視，但關(guān)于淋巴道轉(zhuǎn)移的機制目前仍不清楚，特別是關(guān)于癌組織中淋巴管的數(shù)量、密度是否增加，是否存在淋巴管的新生等問題仍存在較大爭議。

本實驗通過對61例鼻咽癌的研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌周邊組織中LVD明顯高于腫瘤組織內(nèi)，并且淋巴管密度的增加與VEGF－C的增加顯著相關(guān)。分析VEGF－C和LVD與鼻咽癌病理參數(shù)之間的聯(lián)系也發(fā)現(xiàn)，LVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，VEGF－C的表達與癌組織中的LVD顯著相關(guān)，但VEGF－C的表達以及LVD均與患者的年齡、性別、T分期無關(guān)。這說明在癌組織中VEGF－C的增高是促進LVD增高的重要條件之一，而LVD的增高無疑將有利于癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。VEGF－C的這種作用可能是通過其受體 VEGFR－3來實現(xiàn)的，癌組織中VEGFR－3的表達也增高，這使得 VEGF－C的作用得到了更加充分的發(fā)揮。由癌細胞產(chǎn)生大量的VEGF－C與腫瘤周圍間質(zhì)內(nèi)或存在于原有淋巴管內(nèi)皮細胞上的VEGFR－3結(jié)合，誘導 VEGFR－3酪氨酸激酶磷酸化，進而促進了內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，使新的淋巴管生成以及原有淋巴管的分支和出芽，造成了淋巴管數(shù)量和密度的增加，使得癌細胞有更多的途徑沿這些淋巴管向外播散和轉(zhuǎn)移，這可能是癌細胞沿淋巴道轉(zhuǎn)移的機制之一。

通過本實驗的研究，我們認為癌組織中的淋巴管將有可能作為臨床進行腫瘤治療的靶點，這將可能為腫瘤的抗轉(zhuǎn)移治療提供新的方向。

［1］ Kukk E，Lymboussaki A，Taira S，et al.VEGF－C receptor binding and pattern of expression with VEGFR－3 suggests a role in lymphatic vascular development〔J〕.Development，2006，122(12):3829.

［2］ Weidner N，F(xiàn)olkman J，Pozza F，et al.Tumor angiogenesis:a new significant and independent prognostic indicator in early－stage breast carcinoma〔J〕.JNatl Cancer Inst，1992，84(24):1875.

［3］ 張賀龍，王文亮.腫瘤淋巴管形成與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究進展〔J〕.臨床與實驗病理學雜志，2002，18(4):419.

［4］ He Y，Kozaki K，Karpanen T，et al.Suppression of tumor lymphangiogenesis and lymph node metastasis by blocking vascular endothelial growth factor receptor 3 signaling〔J〕.J Natl Cancer Inst，2006，94(11):819.

［5］ Taniguchi K，Kohno R，Ayada T，et al.Spreads are essential for embryonic lymphangiogenesis by regulating vascular endothelial growth factor receptor 3 signaling〔J〕.Mol Cell Biol，2007，27(12):4541.

［6］ 李慧文，張秀清.VEGF－C和 VEGFR－3在舌癌組織中的表達及其和腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系〔J〕.現(xiàn)代口腔醫(yī)學雜志，2004，18(5):412.

［7］ 楊 艷，葛榮明.VEGF和VEGF－C在喉癌中的表達及臨床意義〔J〕.臨床耳鼻咽喉科雜志，2006，16(12):650.

［8］ 曲行舟，王麗珍，胡永杰，等.VEGFR－3在不同臨床分期舌癌癌周淋巴管中的表達〔J〕.口腔頜面外科雜志，2007，17(2):123.

［9］ Karpanen T，Wirzenius M，M?kinen T，etal.Lymphangiogenic growth factor responsiveness is modulated by postnatal lymphatic vessel maturation〔J〕.Am J Pathol，2006，169(2):708.