林 錦 郭巧娟 韓 露 陳奇松 宗井鳳 潘建基 林少俊

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是1種人類致瘤性DNA皰疹病毒，與鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)發(fā)生密切相關。潛伏膜蛋白1(latentmembrane protein-1，LMP-1)是EB病毒編碼產物中被證實具有癌基因功能的蛋白質之一，現(xiàn)已證明其可通過一系列復雜的調節(jié)機制抑制細胞凋亡，促進細胞無限制增生，可能在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起關鍵作用。本研究采用PCR方法，檢測鼻咽癌患者鼻咽拭子中LMP-1的表達情況，分析LMP-1與NPC臨床病理特征的相關性，以為LMP-1應用于診斷及靶向性治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2007～2008年福建省腫瘤醫(yī)院放療科收治的經病理檢查確診的鼻咽癌初診患者129例，中位年齡46歲(14～77歲)，男性92例，女性37例。入組患者均在治療前接受超聲及影像學檢查，并在“鼻咽癌2008分期”發(fā)表后對所有患者重新分期:T12例，T233例，T351例，T443例;N012例，N117例，N287例，N313例;M0122例，M17例。Ⅰ期0例，Ⅱ期10例，Ⅲ期62例，Ⅳ期57例。病理類型:角化型癌28例，非角化型癌101例。所有入組對象均告知試驗的目的和可能存在的風險，征得同意并簽署知情同意書。

1.2 儀器和試劑

PCR儀(BIO-RAD公司產品)，DNA試劑盒(QI-GEN公司產品)，DNA聚合酶(TAKARA公司產品)，Marker(上海博鴻公司產品)，貝克曼高速冷凍離心機(Sigma公司產品)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司產品)，紫外投射分析儀(上?？岛坦怆妰x器有限公司產品)，B95-8細胞株來自我院放射生物學實驗室。

1.3 鼻咽拭子標本采集

具體方法見參考文獻［1］，若未提取到足夠的DNA用于PCR檢測，則重復采集。

1.4 DNA 提取

具體方法見參考文獻［1］。

1.5 PCR法檢測LMP-1基因

于微量離心管中混合下列反應體系:5μL提取DNA，20μmol/L上游和下游引物(BN1為 5’-AGCGACTCTGCTGGAAATGAF-3’，BN2 為 5’-TGATTAGCTAA GGCATTCCCA-3’)各 1 μL，2.5 mmol/L dNTP(脫氧三磷酸核苷)5 μL，10×PCR MIX 5 μL，0.25μL單位耐熱DNA聚合酶(含1.25 U)，加無菌水至50μL。PCR程序:95℃預變性5 min，熱循環(huán):35個循環(huán)，94℃變性30 s、50℃退火30 s，72℃延伸60 s。最后72℃延伸10 min，4℃保存。瓊凝膠電泳，溴乙錠染色顯影DNA，所使用的DNA marker為上海博鴻公司產品，PCR產物在膠上顯示位于100 bp與1 000 bp間，符合實驗的設想，說明所得的條帶為Lmp-1，另以B95-8細胞提取的DNA經PCR檢測的陽性條帶作為陽性對照，無菌水反應作為陰性對照。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理，行 χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽拭子中LMP-1表達情況

試驗組129例中114例LMP-1呈陽性表達(88.37%)。經PCR法檢測LMP-1陽性表達的條帶見圖1，maker在100～1 000 bp，約在290 bp處可見清晰的擴增條帶。

圖1 PCR法檢測LMP-1基因的表達

2.2 LMP-1表達與鼻咽癌臨床病理特征的關系(表1)

LMP-1表達與鼻咽癌患者性別、年齡、T分期、臨床分期無顯著相關性(P＞0.05)。N0期與 N1～3期比較LMP-1陽性表達率差異具有顯著性(χ2=9.7925，P＜0.05)。遠處轉移組與無遠處轉移組LMP-1陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 LMP-1表達與鼻咽癌臨床病理特征的關系(例)

3 討論

EB病毒是1種具有致瘤潛能的DNA皰疹病毒，其基因產物有3種潛伏性膜蛋白 (LMP1、LMP2A和LMP2B)，其中LMP-1是1984年在 EB病毒轉化的B淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)的含量最豐富的病毒產物，其生物學功能具有多效性，Wang等研究發(fā)現(xiàn)，LMP-1表達會使鼠成纖維細胞Rat-1細胞的形態(tài)學發(fā)生變化，導致細胞無限制增殖，細胞間失去接觸抑制，并發(fā)生惡性轉化［2］，此后大量研究還表明其可惡性轉化原代B細胞和人上皮細胞，而被列為癌基因。

近年來，對LMP-1的生物學研究還表明，其可以促進EB病毒陽性的鼻咽癌細胞轉移。體內外研究中應用RNA干擾技術，抑制鼻咽癌細胞中LMP-1基因的表達，使細胞的貼壁生長能力大大提高，基膜穿透能力和細胞移動能力明顯下降，提示LMP-1基因可影響鼻咽癌細胞的轉移潛能［3～5］。

文獻報道采用免疫組化方法，檢測鼻咽活組織中LMP-1的表達，發(fā)現(xiàn)LMP-1的陽性表達率在43% ～72.5%［6～12］。我們采用PCR 法檢測鼻咽拭子中 LMP-1基因的表達，陽性表達率為88.37%，明顯高于免疫組化法［6～12］。進一步分析發(fā)現(xiàn)淋巴結陽性組(N1～3)LMP-1陽性表達率明顯高于淋巴結陰性組(N0)，差異有顯著性，與文獻報道的一致［6～9］，進一步驗證了LMP-1與鼻咽癌轉移有關的論點。但有研究者認為，LMP-1的表達水平在鼻咽癌不同N分期之間的差異無統(tǒng)計學意義［10，11］，考慮可能與這兩個研究中樣本量較小有關(分別為40例及38例)。

有學者對LMP-1與遠處轉移的關系進行分析，發(fā)現(xiàn)LMP-1表達與遠處轉移顯著相關［7］，故若能在患者初診時做LMP-1的檢測就可以預測鼻咽癌患者的轉移潛能，指導臨床制定個體化的治療方案，提高鼻咽癌的生存率，做為隨訪及評價預后的指標之一，并為LMP-1用于抗腫瘤轉移的靶向治療提供依據(jù)。本實驗首診無遠處轉移(M0)患者122例中有107例LMP-1呈陽性表達，表達率為87.70%，而另外首診有遠處轉移(M1)的7例患者LMP-1均呈陽性表達，表達率為100%，高于M0組，但是無統(tǒng)計學差異，與文獻報道的相反［7］?？紤]可能原因為在我們的入組患者中多為早中期患者，考慮有部分轉移機率高的患者在出現(xiàn)遠處轉移前就診，有待于今后進行更大規(guī)模的試驗明確。

LMP-1引起腫瘤轉移的機制尚不是很明確，現(xiàn)有研究表明，LMP-1 可以通過誘導 C-Met、Twist、MMP-9、DcR3、Ezrin、COX-2 原癌基因的表達［8，11，13～16］，進而改變腫瘤細胞極性及細胞運動、調節(jié)腫瘤細胞間黏附及細胞與細胞外基質黏附，在腫瘤轉移過程中發(fā)揮重要作用。LMP-1還通過激活DNMT1，3A and 3B引起細胞黏附分子E-鈣黏蛋白啟動子的甲基化進而導致E-鈣黏蛋白的表達減少，使表達LMP1的上皮細胞具有更高的轉移潛能［17］。再者，LMP-1可以上調HIF-1的表達水平，進而促進 HIF-1下游促轉移基因的表達［18］。腫瘤轉移與血管形成密切相關，研究還發(fā)現(xiàn)LMP-1 與瘤內的血管形成密切相關［6，7］，LMP-1 可以通過STAT3調控VEGF的表達，引起腫瘤新生血管增多、通透性增大，促進淋巴結轉移的可能性［19］，LMP-1還可以通過調節(jié)EGFR的表達及通過NF-κB介導的信號轉導途徑，反向激活糖基化終末產物受體(RAGE)基因而影響腫瘤新生血管的形成［9，20，21］。

LMP-1表達與鼻咽癌其他臨床病理參數(shù)是否有關，目前研究報道未完全一致。我們發(fā)現(xiàn)LMP-1表達與鼻咽癌患者的臨床分期無關，與部分報道的一致［8，11，12］，但姜武忠等認為晚期鼻咽癌(Ⅲ、Ⅳ期)組織中LMP-1陽性表達率高于早期鼻咽癌(Ⅰ、Ⅱ期)，差異具有顯著性［7］。因這些研究依據(jù)的分期標準不一，有的依據(jù) 1997 年 UICC 分期標準［8，11，12］，也有的依據(jù)1992年福州分期標準［7］，故LMP-1表達與鼻咽癌臨床分期是否有關尚不能定論，我們對其病理類型進一步分析發(fā)現(xiàn)，非角化型癌的 LMP-1陽性表達率為90.10%，高于角化型癌82.14%，但是經過統(tǒng)計學處理后發(fā)現(xiàn)差異無顯著性，與文獻報道的相反［12］，有待于今后擴大樣本量進一步確定。我們的研究結果還提示，LMP-1表達與不同臨床T分期、年齡及性別無關，與文獻報道的一致［7，8，11，12］。

本研究結果顯示，鼻咽拭子LMP-1的表達與鼻咽癌頸部淋巴結轉移呈正相關性，但未發(fā)現(xiàn)LMP-1與遠處轉移的相關性。LMP-1增強轉移潛能的機制尚未完全明確，研究LMP-1與各種下游蛋白之間的信號轉導路徑，有助于進一步明確鼻咽癌的轉移機制，對制定有效地抗腫瘤治療措施具有重要的意義。此外，LMP-1還可以預測其放療敏感性、復發(fā)率及遠期生存率［7，22，23］。今后還需要進一步對入組患者進行密切的隨訪，同時擴大樣本量進行研究，明確其對判斷病變進展、預測放療敏感性、評價腫瘤惡性程度及生物學行為的價值。

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