蔣艷萍 曹來英 洛若愚

宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)是與宮頸浸潤癌密切相關(guān)的一組宮頸病理變化，包括CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ等一系列發(fā)生、發(fā)展的連續(xù)過程。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染持續(xù)存在是宮頸上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展的必須條件［1］。許多研究顯示:與并發(fā)HPV感染但無宮頸病變患者比較，高級別CIN病變(CINⅡ和CINⅢ)患者外周血中抗HPV抗原的免疫反應(yīng)降低［2］。然而，細(xì)胞因子在外周血和宮頸黏膜中的表達(dá)并非具有一致性［3］，宮頸組織的局部免疫反應(yīng)在宿主抗HPV感染和宮頸病變的進(jìn)展中也發(fā)揮重要作用［4］。近期研究表明，在多種人類腫瘤中，Treg細(xì)胞參與抑制免疫反應(yīng)，與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)［5］，在宮頸癌的間質(zhì)和上皮組織中表達(dá)增強(qiáng)［6］，參與疾病的發(fā)生。本研究檢測CIN患者宮頸組織中Th1/Th2細(xì)胞因子免疫反應(yīng)和Treg細(xì)胞水平的變化，為CIN的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

選擇2009年7月～2010年5月我院收治的189例女性患者，平均年齡為(34.2±3.3)歲，81例(43%)為良性病變，60例(32%)為 CINⅠ，27例(14%)為CINⅡ，21例(11%)為CINⅢ。每位患者均行HPV檢測、宮頸TCT檢查及宮頸活檢，根據(jù)組織學(xué)結(jié)果按病變程度分為良性病變、CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ四組。選擇研究病例根據(jù)HPV高危型和CIN的病變程度。所有研究患者應(yīng)排除以下條件:絕經(jīng)期婦女、妊娠、慢性疾病(糖尿病、過敏、自身免疫性疾病)、急性感染、口服避孕藥、使用鎮(zhèn)痛藥至少2周以上(非甾體抗炎藥物)。HPV檢測:宮頸組織樣本收集后送醫(yī)院檢驗科檢測。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)本采集 宮頸組織樣本的收集用于細(xì)胞因子的檢測［7］，簡單的說，細(xì)胞刷樣本放入RNA穩(wěn)定劑中，儲存于－80°C。細(xì)胞溶解于Trizol，RNA分離參照說明書進(jìn)行。宮頸活檢組織一部分用于病理檢查，一部分制成單細(xì)胞懸液用于細(xì)胞和細(xì)胞因子的檢測。

1.2.2 引物設(shè)計 從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Entrez核酸數(shù)據(jù)庫(Entrez Nucleotides database)中檢索，應(yīng)用設(shè)計軟件Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計，然后將設(shè)計出的引物輸入BLAST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較，最終得到特異的引物序列。所有引物均由上海賽百勝生物公司合成。設(shè)計出的引物序列如下:IL-2 sense primer:5’-TATGCATCCGAGAC AATGGTTC-3’，IL-2 antisense primer:5’-CGAATTCTCAGACTTTAGGTGC-3’;IL-4 sense primer:5’-ACAAAAATCACTTGAGAGAGATCAT-3’，IL-4 antisense primer:5’-AGT TCCATTTGCATGATGCTCTT-3 ’;IFN-γ sense primer:5’-GAACGCTACACAC TGCATC-3’，IFN-γ antisense primer:5’-GA GCTCATTGAATGCTTGG-3’;IL-10 sense primer:5’-ACAGCTCAGCACTGCTCTG-3’，IL-10 antisense primer:5’-AGTTCACATG CGCCTTG-3’;IL-12 sense primer:5’GCCCAGCTGCTGAGGAGAGT-3’，IL-12 antisense primer:5’-TGGGTGGGTCAGGTTTGATG-3’;GAPDH sense primer:5’-ACAACAGCCT CAAGATCATCAG-3’，GAPDH antisense primer:5’-GGTCCACCACTGA CACGTTG-3’。

1.2.3 宮頸組織微量RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄合成CDNA 宮頸組織使用微量RNA提取試劑盒(QIAGEN)提取總RNA，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。用MBI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μl，全過程在冰上進(jìn)行。

1.2.4 Q-PCR檢測 實驗中 Q-PCR所用染料為SYBR Green。反應(yīng)條件均為95℃12 min，然后95℃15 s，60℃ 60 s，共45個循環(huán)。以GAPDH的表達(dá)量作為內(nèi)參照。采用SYBR Green試劑可通過每1個PCR擴(kuò)增反應(yīng)中循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行實時檢測，從而記錄產(chǎn)物量。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測宮頸組織中Treg細(xì)胞的變化

將收集的宮頸組織單細(xì)胞懸液計數(shù)，每樣本細(xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)到1×106個。檢測Treg細(xì)胞，加入鼠抗人CD4-FITC單克隆抗體、鼠抗人CD25-PE單克隆抗體、鼠抗人CD127-ACEXA647單克隆抗體，室溫孵育30 min。處理好的樣品置流式細(xì)胞儀按常規(guī)進(jìn)行分析，以相應(yīng)的熒光標(biāo)記的同型對照IgG1染色細(xì)胞作為陰性對照，應(yīng)用EXPO2軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析采用InStat軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用χ2檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 4組HPV檢測結(jié)果

4組患者HPV檢測的結(jié)果見表1。

表1 4組患者HPV檢測情況(例，%)

2.2 Treg細(xì)胞表達(dá)的檢測

統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，CINⅡ 、CINⅢ患者宮頸組織(cervix biopsy，CB)中Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例分別為(7.0 ±1.3)%、(7.3 ±1.4)%，高于良性病變及 CINⅠ患者的(4.9 ±0.9)%和(5.4 ±1.1)%，P ＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖 1。

圖1 4組宮頸組織中Treg/CD4+T細(xì)胞的比例

2.3 Th1/Th2細(xì)胞因子的檢測

良性病變、CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ組宮頸組織(CB)中 IFN-γ 表達(dá)水平分別為(6.2 ±1.9) ×103、(5.7 ±1.6)×103、(4.2 ±1.1)×103、(3.9 ±1.0)×103拷貝，逐漸下降，其中良性病變和CINⅠ組高于CINⅡ和CINⅢ組，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。IL-10表達(dá)水平在良性病變、CINⅠ、CINⅡ 和CINⅢ組宮頸組織(CB)中分別為(3.1 ±0.9) ×103、(3.3 ±1.1) ×103、(4.7 ±1.3)×103和(5.0 ±1.6)×103拷貝，逐漸上升，且CINⅡ和CINⅢ組高于良性病變和CINⅠ組，P ＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。IL-2、IL-12 及 IL-4 表達(dá)水平在4組患者中無明顯差異，見圖2。

圖2 4組宮頸組織中IFN-γ、IL-10表達(dá)情況

3 討論

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤患者體內(nèi)Th2型細(xì)胞因子占優(yōu)勢狀態(tài)，機(jī)體免疫反應(yīng)向Th2偏移［8］。宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)是與宮頸浸潤癌密切相關(guān)的一組宮頸病理變化，既往關(guān)于患者體內(nèi)細(xì)胞因子變化的研究數(shù)據(jù)多來源于外周血。本文的研究顯示:相比較正常良性病變和輕度CIN病變患者，中、重度CIN患者(CINⅡ 和CINⅢ)宮頸組織中 IFN-γ表達(dá)水平下降。IFN-γ由Th1型細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞及活化的NK細(xì)胞分泌，介導(dǎo)有效的Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)，對抗HPV感染。HPV持續(xù)感染與IFN-γ分泌下降密切相關(guān)，并引起宮頸內(nèi)瘤病變的進(jìn)展［9］。本文來源于宮頸組織中IFN-γ的研究結(jié)果與既往相關(guān)報道結(jié)果一致。其他的Th1型細(xì)胞因子如IL-2在4組患者宮頸組織中的表達(dá)無明顯變化。

在宮頸內(nèi)瘤變的發(fā)展過程中，通過外周血中Th2型細(xì)胞因子如IL-4和IL-10的高表達(dá)，使機(jī)體偏向于Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)。在本文研究組患者的宮頸組織中，IL-4的濃度沒有明顯變化，IL-10的濃度隨著CIN病變程度的增加而明顯增加。IL-10在免疫抑制中發(fā)揮重要的作用，抑制T細(xì)胞的激活和Th1細(xì)胞的分化。有研究者報道，在中、重度的鱗狀上皮病變中，IL-12∶IL-10的比例明顯下降，表現(xiàn)為偏向于Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)［10］。IL-12是細(xì)胞免疫中重要的免疫調(diào)節(jié)因子，它可以促進(jìn)NK細(xì)胞和CTL的活性，能刺激T細(xì)胞及NK細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)分泌多種細(xì)胞因子，尤其是IFN-γ。我們研究發(fā)現(xiàn)，隨著CIN病變的進(jìn)展，研究組患者宮頸組織中IFN-γ、IL-12、IL-2表達(dá)水平無明顯變化或表達(dá)下降，與IL-10的比例呈明顯下降趨勢，支持和擴(kuò)展了既往的一些研究結(jié)果，表明機(jī)體抗HPV感染的細(xì)胞免疫反應(yīng)下降，導(dǎo)致CIN病變的進(jìn)行性發(fā)展。

Treg 的表面標(biāo)志為 CD4、CD25、FOXP3，這些表面標(biāo)志在人類Treg細(xì)胞的檢測中存在爭議，研究表明CD4+CD25+CD127low/-可作為 Treg細(xì)胞檢測的標(biāo)志。既往關(guān)于Treg細(xì)胞和CIN病變的相關(guān)研究較少，有研究表明在CIN及宮頸癌患者外周血單核細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例增加，如果清除CD25+T細(xì)胞能提高HPV16 E6-和E7特異性輔助T細(xì)胞反應(yīng)，表明內(nèi)在的抗HPV反應(yīng)存在［11］，并且Treg細(xì)胞參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，研究顯示了人體系統(tǒng)(外周血)中的Treg細(xì)胞數(shù)增加與HPV持續(xù)感染存在關(guān)聯(lián)性。而我們的研究結(jié)果來源于局部宮頸黏膜水平，顯示CIN病變患者宮頸組織中Treg細(xì)胞數(shù)增加，并隨病變程度的加重呈漸進(jìn)性增加;同時，CIN程度的增加，高危型HPV感染比例增加，宮頸黏膜組織中Treg細(xì)胞數(shù)增加亦與HPV的持續(xù)感染密切相關(guān)。既往的研究和本文的研究分別從系統(tǒng)水平和宮頸黏膜局部水平，支持了Treg細(xì)胞下調(diào)機(jī)體抗HPV感染的免疫反應(yīng)這一假設(shè)，導(dǎo)致CIN病變的漸進(jìn)性發(fā)展。

總之，在HPV感染引起的宮頸CIN病變的進(jìn)展過程中，宮頸組織中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)發(fā)生變化:IFN-γ表達(dá)水平下降，IL-10表達(dá)水平增高，表明了Th1/Th2平衡向Th2偏移;在宮頸黏膜中Treg細(xì)胞表達(dá)隨CIN病變程度的增加而增加。細(xì)胞因子和Treg細(xì)胞的變化下調(diào)機(jī)體抗HPV感染能力和抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，應(yīng)用相應(yīng)的免疫治療等手段糾正機(jī)體的免疫紊亂，可能增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，克服腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸和免疫封閉，為防治HPV感染所致的癌前病變中提供治療的靶點。

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