王旭洲 余英豪 黃惠娟 宋嶼娜 謝飛來 吳 敏

人乳頭瘤病毒(human papilloma viruses，HPV)是1種可引起人類皮膚和黏膜組織良性及惡性腫瘤的病毒，在人類的感染非常普遍。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的HPV有100多個型別，各型別與體內(nèi)特定感染部位和病變有關(guān)，其中40多個型別與人類生殖道疾病有關(guān)［1］。進(jìn)一步可分成與生殖道疣相關(guān)的低危型與宮頸癌相關(guān)的高危型。應(yīng)用HPV分型技術(shù)對難以確定的非典型鱗狀上皮細(xì)胞(atypical squamous cells of undetermined signification，Asc-us)和宮頸脫落細(xì)胞輕度病變作進(jìn)一步的判斷，是1種有效的再分類方法［2］。本文采用核酸分子快速導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)(flowthrough hybridization and gene chip)和表面等離子諧振技術(shù)(簡稱SPR)，對50例Asc-us病例標(biāo)本進(jìn)行檢測，探討對Asc-us病例的分流監(jiān)測和宮頸癌初篩的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

50例我院門診宮頸薄層液基細(xì)胞學(xué)(LCT)檢查結(jié)果為Asc-us的病例，年齡21～82歲，平均36.75歲，均無急性生殖道炎、子宮頸錐切和子宮切除史。

1.2 研究方法

1.2.1 LCT檢測 LCT采用美國 PREPSTAIN公司RSP-5051型液基細(xì)胞儀(包括細(xì)胞采集系統(tǒng)及檢測系統(tǒng))。細(xì)胞采集方法:將取樣毛刷插入宮頸內(nèi)，按同一方向轉(zhuǎn)動毛刷5周;取出后折斷毛刷頸，將毛刷頭放入液基瓶中送檢;置液基瓶于震蕩器上震蕩，將毛刷頭上的細(xì)胞洗脫。檢測方法:①將標(biāo)本有秩序地放入取材框，黏貼標(biāo)簽，放入注射器，加入4 ml密度液，逐個振蕩20 s;②打開取材機(jī)，將標(biāo)本框放入取材機(jī);③將取完材的標(biāo)本按順序放入對號的離心盒內(nèi)并進(jìn)行離心;離心后取出標(biāo)本進(jìn)行抽吸黏液:打開抽吸泵，將標(biāo)本逐個抽吸，每管均一致，再將標(biāo)本放入離心機(jī)進(jìn)行二次離心;④倒去標(biāo)本上清液，留下“沉淀物”，逐個振蕩20 s，將標(biāo)本(離心盒應(yīng)對號入座)放入主機(jī)，開機(jī)等待10 min并染色;⑤系統(tǒng)自動進(jìn)入染色程序。染色后的片子先放入異丙醇-無水酒精(1∶1)后直接移入二甲苯中，5 min后封片、貼標(biāo)簽，顯微鏡下觀察。診斷參考2001年修訂的TBS系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)［3］。

1.2.2 HPV分型檢測 HPV基因擴(kuò)增分型檢測試劑盒，核酸分子快速導(dǎo)流雜交基因芯片和SPR平臺均由北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供。待測標(biāo)本為上述LCT確定為Asc-us病例的子宮頸脫落細(xì)胞樣本，用專用細(xì)胞保存液保存。主要步驟如下:取1 ml細(xì)胞懸液加入離心管內(nèi)，12 000 rpm離心10 min，棄去上清，500 μl細(xì)胞清洗液沖洗細(xì)胞，12 000 rpm離心10 min，重復(fù)2次，加入200μl的 DNA快速裂解提取液，56℃15 min，95℃15 min 后，12 000 rpm 離心 3 min，吸取上清液10μl加入到PCR反應(yīng)體系中按照擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增(每次均同時擴(kuò)增一陽性對照)，取陽性擴(kuò)增產(chǎn)物20μl和雜交緩沖液60μl加入每個擴(kuò)增反應(yīng)管內(nèi)，置水浴鍋或PCR儀中95℃加熱5 min后，點(diǎn)樣雜交。雜交過程在核酸分子快速導(dǎo)流雜交基因芯片儀W2600型SPR平臺上進(jìn)行。HPV分型芯片涵蓋24型(高危型:16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68 型;低危型:6、11、40、42、43、44、54 和70 型)。

1.2.3 陰道鏡檢查及病理活檢 所有Asc-us病例均由本院婦產(chǎn)科醫(yī)生進(jìn)行陰道鏡檢查，對可疑病灶進(jìn)行陰道鏡下定位活檢。鏡下未發(fā)現(xiàn)明顯異?；驁D像不滿意者，則行宮頸多點(diǎn)活檢。所有活檢標(biāo)本以各項(xiàng)診斷中最高級別作為組織病理學(xué)最后診斷依據(jù)。根據(jù)子宮頸鱗狀上皮細(xì)胞異常增生程度分為無上皮內(nèi)瘤變或惡性變(negative for intraepithelial lesion or ma1ignancy，NILM)，子宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級。凡≥CINⅡ級定義為子宮頸高度病變。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

以組織病理學(xué)檢查結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV分型檢測結(jié)果

50例中HPV陽性23例(46.0%)，其高危型HPV陽性者17例(同時合并低危型HPV陽性者4例)，單純低危型HPV陽性者6例(合并感染4例)，HPV陰性者27例。

2.2 組織病理學(xué)檢查結(jié)果

50例中無NILM 病例，CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ級分別為15、26和9例，其中子宮頸高度病變35例(70.0%)。在子宮頸高度病變者中高危型HPV陽性病例15例(42.9%)，單純低危型 HPV 陽性4例(11.4%)，合并感染4例，HPV分型陰性16例(45.7%)。組織學(xué)檢查結(jié)果與HPV基因分型的對應(yīng)關(guān)系見表1。

表1 Asc-us病例HPV基因分型與組織學(xué)檢查結(jié)果的對應(yīng)關(guān)系(例)

2.3 HPV分型與子宮頸高度病變的關(guān)系

高危型HPV陽性病例中子宮頸高度病變率為88.2%(15/17)，其中1例同時有5個型別高危型HPV 感染(31，56，59，66，81);單純低危型 HPV 陽性病例中子宮頸高度病變率為66.6%(4/6)，HPV分型陰性病例中子宮頸高度病變率為59.3%(16/27)，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)處理χ2檢驗(yàn)，三者子宮頸高度病變率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

3 討論

子宮頸鱗狀上皮細(xì)胞與柱狀上皮細(xì)胞的連接處是HPV的易感部位［4］，由于HPV病毒尚未在活細(xì)胞里分離成功，因此難以用細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)HPV。人感染HPV后，機(jī)體產(chǎn)生的抗體在體內(nèi)可長期存在，血清學(xué)方法檢查抗體不能確定是近期感染或既往感染。因此，發(fā)展新的診斷HPV感染方法主要通過分子生物學(xué)檢測來實(shí)現(xiàn)。目前用于HPV分型檢測的方法主要有原位雜交技術(shù)、型特異性PCR和通用引物PCR技術(shù)、實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)和雜交捕獲技術(shù)等［5］。

表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)技術(shù)是研究生物分子相互作用的重要工具之一，該技術(shù)使生物分子之間相互作用的實(shí)時檢測成為可能，并且靈敏度高、是1種無標(biāo)記和實(shí)時動態(tài)的快速檢測方法。通過分析傳感圖譜及分子相互作用的響應(yīng)值獲取分子相互作用的模式和動力學(xué)常數(shù)等信息，并且能夠?qū)Λ@得的信息進(jìn)行定性和定量。SPR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物、化學(xué)、免疫學(xué)研究及新藥開發(fā)等領(lǐng)域［6，7］。但應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行HPV分型檢測，文獻(xiàn)中尚未見報道。本研究采用北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供的HPV核酸擴(kuò)增分型檢測試劑盒和W2600型SPR技術(shù)平臺檢測24種HPV亞型，可同時檢測出多型感染，并可判斷是持續(xù)感染或再次感染，該試劑盒性能穩(wěn)定，重復(fù)性好。

自20世紀(jì)50年代開始采用傳統(tǒng)巴氏涂片大規(guī)模實(shí)施子宮頸癌篩查以來，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率明顯下降。近年發(fā)展起來的液基薄片技術(shù)在制片技術(shù)上取得的進(jìn)步，減少了涂片的不滿意率，降低了漏診率［8］。2001年修訂后TBS診斷系統(tǒng)以明確、恰當(dāng)?shù)姆绞奖磉_(dá)細(xì)胞學(xué)判讀結(jié)果。促進(jìn)了子宮頸/陰道細(xì)胞病理學(xué)診斷報告系統(tǒng)的統(tǒng)一，達(dá)到細(xì)胞病理與臨床的有效交流。本研究即采用LCT進(jìn)行子宮頸細(xì)胞學(xué)檢查，并采用TBS系統(tǒng)來描述上皮細(xì)胞異常的分類，順應(yīng)了國際細(xì)胞學(xué)診斷規(guī)范化潮流或趨勢。

本文選用病例LCT結(jié)果均為Asc-us。Asc-us是LCT診斷中介于正常鱗狀細(xì)胞與異常細(xì)胞之間的一組細(xì)胞，其診斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核增大，是正常中層鱗狀細(xì)胞核的2.5倍左右，核漿比例輕度增加。染色質(zhì)輕微增多、分布不規(guī)則或核的形狀不規(guī)則，有致密橘紅色胞質(zhì)的角化不良細(xì)胞常見。Asc-us既可以是良性反應(yīng)性改變，也可能有潛在的癌前病變甚至子宮頸癌［9］。正因?yàn)锳sc-us這種雙向意義，我們選擇其為研究對象，以期給這類病例的后續(xù)診治提供幫助。目前在世界范圍內(nèi)已經(jīng)確認(rèn)感染高危型HPV是引起子宮頸癌及其癌前病變的必要因素，99.8%的子宮頸癌病例存在高危型HPV感染［10］。本研究結(jié)果顯示，在50例Asc-us病例中高危型HPV的陽性率為34%(17/50);35例子宮頸高度病變高危型HPV的陽性率高達(dá)42.85%(15/35)，明顯高于陰性單純低危型HPV感染者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與文獻(xiàn)報道的相近。提示對于液基細(xì)胞學(xué)診斷為Asc-us的病例，應(yīng)進(jìn)行HPV分型檢測，如提示高危型HPV陽性應(yīng)立即進(jìn)行陰道鏡檢查和活檢，將有助于提高子宮頸高度病變的檢出率。如無高危型HPV感染者可進(jìn)行細(xì)胞學(xué)隨訪，減少不必要的陰道鏡檢查，減輕病例負(fù)擔(dān)，節(jié)約醫(yī)療資源。

總之，HPV基因分型檢測對子宮頸細(xì)胞學(xué)結(jié)果為Asc-us的病例能有效地進(jìn)行分流監(jiān)測，降低對子宮頸高度病變的漏診率，提高篩查效力。

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