吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院 張輝 李鵬 閆峰 叢立新 常維毅

舒蘭市獸醫(yī)衛(wèi)生監(jiān)督所 馬玉杰

舒蘭市水曲柳鎮(zhèn)畜牧站 任寶文

大理石紋是評定牛肉品質(zhì)的重要因素，其主要取決于肌內(nèi)脂肪（IMF）含量的高低。脂聯(lián)素（ADPN）是脂肪組織基因表達最豐富的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之一，可以調(diào)節(jié)脂肪代謝，是機體脂質(zhì)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)節(jié)因子（Yamauchi等，2001）。本試驗研究了不同能量水平日糧對延邊黃牛不同育肥時期肌內(nèi)脂肪含量和脂肪細胞因子脂聯(lián)素表達的關(guān)系，為探討肉牛肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的主要酶類提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與分組 選取24頭體況中等的健康延邊黃牛，隨機分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三組，每組8頭牛，平均體重約300 kg、平均年齡1.5歲，體重組間差異不顯著（P＞0.05）。經(jīng)過10 d預(yù)試期，逐漸增加精飼料的日喂量，達到設(shè)定的營養(yǎng)水平后正式開始前期肥育試驗，肥育試驗共120 d。肥育結(jié)束后，每組肉牛全部屠宰，采集主要肌肉塊檢測肌內(nèi)脂肪含量，同時采集脂肪樣品，用熒光定量法檢測ADPN表達量。

1.2 試驗材料

1.2.1 主要試劑 低熔點瓊脂糖購自BRL公司。Trizol試劑，Gibco公司產(chǎn)品；焦磷酸二乙酯（DEPC）為 Sigma 公司產(chǎn)品，瓊脂糖、Tris、蛋白胨、酵母提取物為TaKaRa公司產(chǎn)品。氯仿、異丙醇、乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑；飽和酚、十二基烷硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸鈉（EDTA）等購自長春Biotech公司。標準分子質(zhì)量DNA Marker DL-2000（分子質(zhì)量為 2000、1000、750、500、250、100 bp）購自TaKaRa公司。

1.2.2 主要工具酶及宿主菌 T4 DNA連接酶，RNasin購自Promage公司，Ex Taq酶購自TaKaRa公司，反轉(zhuǎn)錄酶AMV Reverse Transcriptase為NEB公司產(chǎn)品。載體pMD18-T Vector購自TaKaRa公司，JM109宿主菌為本實驗室自制。

1.2.3 主要儀器設(shè)備 PCR儀Tpersonal 2000型（Biometra，German）、ABI PRISM 7000 型熒光定量PCR擴增儀（美國ABI公司）；高速冷凍離心機MR18.22型（日本日立）、高速臺式離心機（TGL.16G上海安亭離心機廠）；GeneQuant核酸濃度測定儀（英國 pharmacia Biotech，Ltd 公司）；電泳儀DY-Ⅲ型（北京六一儀器廠）；紫外透射反射分析儀WP型（永嘉上塘儀器廠）；恒溫水浴箱（丹東市醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）；空氣浴振蕩器（上海智城ZHWY-103D）；數(shù)顯不銹鋼鼓風干燥箱；脂肪測定儀（SZF-06A上海新嘉電子有限公司）。

1.3 日糧組成與飼養(yǎng)管理 分別給Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組試驗牛飼喂三個水平能量比的日糧。粗料為玉米秸桿，每頭牛單圈單槽飼喂，每天自由采食。各組試驗牛日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.4 樣品采集 分別于19、20、21月齡和 22月齡，采集牛尾部脂肪樣品500 mg，存于液氮中備用。采集胴體胸肉、腰肉、眼肉、腱子肉、上腦等主要部位肌肉各300 mg，冷凍備用。

1.5 測定指標 不同肌肉內(nèi)脂肪含量為肌肉干物質(zhì)中脂肪所占百分比，采用索氏浸提法進行測定。同時測定日增重、屠宰前活重、胴體重和屠宰率；脂肪樣品中ADPN mRNA的表達水平采用熒光定量RT PCR法進行測定。

1.6 脂肪組織ADPN mRNA水平的檢測

1.6.1 脂肪細胞總RNA的提取及總RNA的反轉(zhuǎn)錄 脂肪細胞總RNA的提取采用Trizol兩步法，具體操作按說明進行。在DNA/RNA定量儀上測定RNA濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA條帶的完整性。根據(jù)測定的濃度，將各樣品RNA用DEPC水調(diào)節(jié)成同一水平，采用AMV反轉(zhuǎn)錄酶，以相同體積的總RNA為模板，以O(shè)ligo-dT為引物進行RT反應(yīng)。取1 μL RT產(chǎn)物進行Real-time PCR反應(yīng)，得出在相同RNA水平上各樣品的ADPN mRNA拷貝數(shù)。

表1 不同能量配比育肥牛日糧組成及營養(yǎng)水平

1.6.2 陽性標準品質(zhì)粒的制備

1.6.2.1 ADPN引物設(shè)計：根據(jù)Genbank中查閱出ADPN序列，利用Primer Express 2.0設(shè)計軟件，分別設(shè)計以下引物（上?；瞪锕こ坦竞铣桑?，見表 2。

表2 試驗所用ADPN引物和探針

1.6.2.2 陽性標準品的質(zhì)粒的制備：屠宰采集的脂肪100 mg提取總RNA反轉(zhuǎn)錄制備成cDNA，常規(guī)PCR。電泳后用凝膠試劑盒回收，連接到PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，克隆后提取質(zhì)粒，進行重組質(zhì)粒的PCR和雙酶切鑒定。將鑒定正確的陽性克隆送上海生工進行序列測定。

1.7 熒光定量RT-PCR方法 采用Pharmacia Biotech公司的RNA/DNA calculator，在260 nm下測定質(zhì)粒的純度及濃度后，用滅菌四餾水分別做101、102、103、104、105、106、107、108、109稀 釋 分 別 作為熒光定量PCR反應(yīng)的陽性標準模板，每個水平設(shè)3個重復(fù)，設(shè)3個陰性質(zhì)控（NTC）。PCR體系為（25 μL）：ddH2O 16.2 μL；10×Taq-buffer 2.5 μL；dNTPs Mixture（各 2.5 m mol/L）2.0 μL；上游引物（12 pmol/μL）、下游引物（12 pmol/μL）、探針（15 pmol/μL） 各 1.0 μL；Ex Taq 酶（1 U/μL）0.3 μL；temperate DNA 1.0 μL。反應(yīng)條件為：先95℃預(yù)變性3 min，然后按95℃變性15 min，60℃退火1min，共計50個循環(huán)。反應(yīng)在ABIPRISM 7000型熒光定量PCR擴增儀（美國ABI公司）上進行。所有反應(yīng)信息資料被ABI PRISM 7000型熒光定量PCR擴增儀收集并儲存于其附件電腦（含相應(yīng)的分析軟件）中，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)陽性定量標準模板的擴增情況自動繪制標準曲線。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，用SPSS 10.0軟件進行分析，組間差異顯著性用ONE-WAYANOVA方差分析進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對生產(chǎn)性能和優(yōu)質(zhì)切塊肌肉脂肪含量的影響 見表3和表4。

表3 對育肥牛生產(chǎn)性能的影響

表3結(jié)果顯示Ⅲ組較Ⅰ、Ⅱ組育肥末期體重、日增重、胴體重和屠宰率顯著增加（P＜0.05），Ⅰ組與Ⅱ組間差異不顯著（P＞0.05）；與Ⅰ組和Ⅱ組相比，Ⅲ組胴體脂肪重、背膘厚度和非胴體脂肪均顯著增加（P＜0.05），Ⅰ組與Ⅱ組間差異不顯著（P ＞ 0.05），本試驗結(jié)果與陳宇等（2006）和杜瑋（2007）試驗結(jié)果相一致。

表4 對育肥牛優(yōu)質(zhì)切塊肌內(nèi)脂肪含量的影響 %

表4結(jié)果顯示，主要肌塊肌內(nèi)脂肪含量除腱子肉、上腦肉外，Ⅲ組顯著高于Ⅰ、Ⅱ組（P＜0.05），Ⅰ組與Ⅱ組間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 對ADPN mRNA水平的影響 延邊黃牛不同育肥時期ADPN mRNA水平的影響見表5。

由表5可見，19～22月齡，Ⅲ組ADPN mRNA水平均顯著高于Ⅰ、Ⅱ組（P＜0.05），但Ⅰ組與Ⅱ組間差異不顯著（P＞0.05）；不同月齡間，試驗Ⅰ組與Ⅱ組ADPN mRNA水平21月齡和22月齡兩個階段均顯著高于19月齡和20月齡（P＜0.05）；試驗Ⅲ組ADPN mRNA水平隨月齡增加而顯著增加（P＜0.05）。經(jīng)相關(guān)分析檢驗，不同處理組，延邊黃牛脂肪組織ADPN mRNA水平與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)關(guān)系（n=8）：Ⅰ組y=3.86+2x（r=0.52；P ＜ 0.001）、 Ⅱ組 y=3.75+2.38x（r=0.61；P ＜0.001）、Ⅲ組 y=5.92+0.53x（r=0.72；P ＜ 0.001）。

表5 對ADPN mRNA水平的影響

3 討論

近年來，研究人員根據(jù)不同的目的，利用基因工程手段對脂聯(lián)素基因進行了克隆表達和基因敲除，對ADPN的生物學(xué)功能及研究不斷深入。Wang等（2004）發(fā)現(xiàn)ADPN mRNA在豬脂肪組織細胞中表達豐富。張國棟（2004）等還對豬脂聯(lián)素進行了成功定位。Sreenivasa等（2005）發(fā)現(xiàn)，雞脂聯(lián)素基因在脂肪組織中表達量最高，其次是肝臟、腺垂體、間腦、腎臟和骨骼肌，提示其可能在體內(nèi)發(fā)揮與哺乳動物不一樣的生物學(xué)功能。Fu等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，在3T3-L1脂肪前體細胞分化為脂肪細胞的過程中，經(jīng)基因轉(zhuǎn)染而表達的ADPN，通過自分泌作用促進了脂肪細胞脂質(zhì)積聚。但有關(guān)脂聯(lián)素基因在肉牛上的研究鮮見報道。

張輝等（2007）研究表明，脂聯(lián)素基因在荷斯坦新生犢牛脂肪前體細胞中低表達，脂肪細胞內(nèi)甘油三酯隨脂肪前體細胞分化成熟逐漸蓄積，ADPN mRNA也逐漸升高，在第12天表達最高，提示脂聯(lián)素基因的表達與脂肪細胞的分化和脂質(zhì)積聚有著密切的關(guān)系。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，延邊黃牛脂肪組織ADPN mRNA水平與肌肉脂肪含量呈正相關(guān)關(guān)系，驗證了上述研究。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明：（1）高能日糧能提高延邊黃牛脂肪組織的ADPN mRNA水平，飼喂同一能量水平日糧，ADPN mRNA水平有隨著育肥日齡增加而增加趨勢。（2）延邊黃牛脂肪組織ADPN mRNA水平與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.001）。

[1]陳寧，尹君亮，李國慶，等.營養(yǎng)調(diào)控劑對育肥牛的影響[J].飼料博覽，2006，2：28 ～31.

[2]杜瑋.不同能量水平和不同營養(yǎng)調(diào)控劑對淘汰西門塔爾、荷斯坦奶牛育肥性能和肉品品質(zhì)影響的比較研究：[碩士學(xué)位論文][D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué).2007.4.

[3]張國棟.豬脂聯(lián)素基因的染色體基因的定位、克隆、表達，抗血清制備及體內(nèi)表達調(diào)控研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[4]張輝，常維毅，張才，等.乳牛前脂肪細胞原代培養(yǎng)過程中ADPN基因和HSL 基因表達水平的檢測[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2007，37（6）：510 ～514.

[5]Fu Y，Luo N，Klein R L，et al.Adiponectin promotes adipocyte differentiation，insulin sensitivity，and lipid accumulation[J].J Lipid Res，2005，46（7）：1369～1379.

[6]Sreenivasa M，Shana M，Olga O，et al.Adiponectin gene is expressed in mulitiple tissues in the chicken：food deprivation influences adiponectin messenGer ribonucleic acid expression[J].Endocrinology，2005，146（10）：4250 ～4256.

[7]Wang P H，Ko Y H，et al.The expression of porcine adiponectin and stearoyl coenzyme A desaturase genes in differentiating adipocytes[J].Asian-Aust J Anim Sci，2004，17：588 ～593.

[8]YamauchiT，Kamon J，WakiH，etal.Thefat-derived hormone adiponectin reverses insulin resistance asscciated with both lipcatrophy and obesity[J].Nat Mad，2001，7（8）：941 ～946.