中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 董穎超 李 俊 李軍國 牛力斌

青貯飼料是指經(jīng)人工調(diào)劑的多汁青飼料，多用于反芻動物的冬春季節(jié)飼喂，對泌乳奶牛尤為重要。李春杰等（2009）認(rèn)為，在青貯過程中導(dǎo)致青貯飼料受霉菌毒素的污染主要有以下兩個原因：一是青貯原料在貯前已被霉菌污染，二是由于青貯制作中水分含量低于70%，水分不足不僅影響乳酸菌微生物的發(fā)酵，而且使空氣難以排凈，引起了霉變。奶牛進(jìn)食受霉菌毒素污染的飼料后，不僅會影響奶牛的生產(chǎn)性能，而且還影響原料奶的安全性，造成奶牛養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，因此有必要建立檢測方法以便監(jiān)控奶牛青貯飼料中霉菌毒素的污染狀況。

嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，是霉菌毒素的一種，可導(dǎo)致動物腸功能紊亂（腹瀉、嘔吐），口腔黏膜和真皮損傷，免疫力下降（孟昭赫，1990）。目前用于檢測DON的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法、薄層層析（TLC）法和高效液相色譜（HPLC）法。ELISA法重現(xiàn)性差，假陽性問題嚴(yán)重，TLC法對環(huán)境和操作人員的污染較大，而HPLC法具有靈敏性高，檢測時間短等優(yōu)點。目前鮮見檢測青貯飼料中DON的檢測方法報道，本研究旨在通過建立青貯飼料中檢測DON的液相色譜法，為進(jìn)一步掌握青貯飼料中DON的污染水平提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料 奶牛用玉米青貯飼料樣品1、2分別取自天津某公司和天津某奶牛養(yǎng)殖場。

1.2 試劑 甲醇（色譜純），購自Thermo-Fisher公司；純水，18MΩ，取自 Millipore系統(tǒng)；DONtest HPLC免疫親合柱，購自北京中檢維康Vicom公司；聚乙二醇8000，購自北京化學(xué)試劑公司；嘔吐毒素（純度 ≥ 98%），購自Sigma-Aldrich公司；GM200均質(zhì)機，德國Retsch公司；EYELA MG2200型氮吹儀，日本精工公司。

1.3 色譜條件 液相系統(tǒng)為Agilent 1100系列，配可變波長檢測器（VWD），色譜柱為Eclipse XDB C18反相柱（4.6 mm×150 mm i.d.，5 μm）；進(jìn)樣量為 50 μL；流動相為 15∶85（V/V）的乙腈水溶液；流速為 1.0 mL/min；等度洗脫；檢測波長220 nm。

1.4 樣品處理方法 將青貯飼料樣品于-20℃冰箱內(nèi)冷凍保藏，檢測前于100℃烘箱內(nèi)烘干2 h后，粉碎，過20目篩，加入一定量聚乙二醇8000，200 mL提取液，Retsch磨 5000 r/min下高速均質(zhì)2 min后，過微纖維濾紙，取一定量濾液，過經(jīng)純水沖洗的免疫親和柱，用一定量色譜級甲醇淋洗柱子，將樣品淋洗液，氮氣吹干，用1 mL甲醇定容，上機測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化 為充分提取樣品中的DON，采用的溶劑組合為甲醇水溶液體系，分別以純水、甲醇-水（V/V，20∶80）、甲醇-水（V/V，40∶60）的混合液作為提取液，其他條件不變，考察不同提取液對提取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提高提取液中甲醇的比例，DON的回收率會略微降低，但混合液中水的比例高時會淋洗出更多的雜質(zhì)，導(dǎo)致基線噪音加大，干擾測定。綜合考慮選擇甲醇-水（V/V，20∶80）作為樣品提取液。圖1為濃度為1.0 mg/L的DON標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖，故將樣品1、2的添加水平設(shè)為1.0 mg/kg進(jìn)行檢測，色譜圖見圖2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)嘔吐毒素的高效液相色譜圖（1.0 mg/L）

2.2 線性范圍 上述測定條件下，發(fā)現(xiàn)濃度在0.1～5.0 mg/L時，DON 的質(zhì)量濃度（X，mg/L）與峰面積（Y）呈良好的線性關(guān)系，嘔吐毒素的工作曲線見圖3。DON的線性回歸方程為

圖2 樣品的高效液相色譜圖（1.0 mg/kg）

Y=-0.41581+58.89623X，R2=0.9997。

圖3 嘔吐毒素工作曲線

2.3 檢出限 以S/N=3為判定標(biāo)準(zhǔn)，青貯飼料中的嘔吐毒素的檢測限可以達(dá)到0.05 mg/L。

2.4 回收率與精密度實驗 結(jié)果見表1，在青貯飼料樣品 1中添加 0.5、1.0、2.0 mg/kg的 DON，測得回收率為82% ～117%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.1%～7.8%。

表1 青貯飼料中嘔吐毒素回收率實驗結(jié)果

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明：（1）本方法中DON的質(zhì)量濃度在0.1～5.0 mg/L，與其峰面積呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9997；（2）青貯飼料樣品通過免疫親和柱處理后，能夠有效的去除基質(zhì)的干擾，具有較好的回收率（82%～117%），本法可用于測定青貯飼料中DON。

[1]李春杰，李長勝，孫雙.玉米青貯HACCP技術(shù)與青霉菌污染防治[J].農(nóng)業(yè)系統(tǒng)科學(xué)與綜合研究，2009，25（3）：361 ～364.

[2]孟昭赫.食品衛(wèi)生學(xué)檢驗方法注解，微生物學(xué)部分[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1990.28.