江蘇大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 (鎮(zhèn)江 212001) 鄭金旭 田安國 黃震杰

在肺纖維化動物模型以及人類特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)中 ,纖維化肺組織局部不僅結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor,CTGF)水平升高,而且還聚集了大量表達平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的肌纖維母細胞。以α-平滑肌肌動蛋白 (α-Smooth muscle actin,α-SM A)為標志蛋白的肌纖維母細胞(Myofibroblasts)是結(jié)締組織損傷修復過程中一過性出現(xiàn)的介于成纖維細胞和血管平滑肌細胞的一類細胞,具有極強的收縮、增殖和分泌細胞外基質(zhì)的能力,損傷修復完成后肌纖維母細胞也隨之消失,因此,正常組織沒有肌纖維母細胞。但在慢性疾病過程中肌纖維母細胞可以持續(xù)存在,導致細胞外基質(zhì)沉積并最終引起組織纖維化(Fibrosis)[1]。轉(zhuǎn)化生長因子 (Transforming grow th factor,TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor,CTGF)肌纖維母細胞與肺纖維化進展過程關系密切。胡永斌等[2]研究表明 TGF-β1能誘導人胚肺成纖維細胞表型活化為肌纖維母細胞。本研究探討 CTGF促進T GF-β1誘導活化的肌纖維母細胞增殖作用及其分子機制。

材料與方法

1 實驗材料 人胚肺成纖維細胞系 HLF,兔抗人 ERK1/2抗體,p-ERK1/2抗體購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生物。 PD98059(ERK1/2活化特異性阻斷劑 )購自 invivogen公司。 CTGF、TGF-β1購自Pepro Tech Inc。α-SM A抗體武漢博士德生物技術有限公司。MT T華美生物技術公司。

2 實驗方法

2.1 Western蛋白印跡法檢測α-SMA蛋白水平待 HLF細胞進入對數(shù)生長期,無血清培養(yǎng)液饑餓24h后,加入 TGF-β1(15ng/ml)預處理細胞 48h后再分為對照組,CTGF刺激組(100ng/ml),PD98059+CTGF刺激組(50 μ M PD98059預處理 30 min后再加100ng/ml CTGF),單獨 PD98059刺激組,以上各組均刺激 48h。用細胞裂解液裂解細胞,用 Bradford法測定蛋白濃度,等量取 70 μ g總蛋白加入等體積無還原劑的 2倍 SDS上樣,用緩沖液混勻,沸水浴 5min。以10%SDS-PAGE電泳分離 (恒壓 80V約 100min),轉(zhuǎn)移蛋白至 PVDF膜上,5%無脂奶粉封閉液中室溫封閉 1h,與適量α-SM A抗體搖床孵育 (4℃,雜交過夜),PBST漂洗 4次 ,每次 10min,HRP標記二抗(羊抗小鼠 )室溫孵育 1h,PBST漂洗 4次,每次 10min.ECL顯色,X膠片曝光。 TYPHOON掃描儀成像,采用Imagequant TL軟件分析蛋白條帶。實驗重復 3次。以β-actin為內(nèi)參。

2.2 MT T法檢測細胞增殖 待 HLF細胞進入對數(shù)生長期,0.25%胰酶消化后制成細胞懸液,按1500/孔接種于 96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng) 24h后,換無血清培養(yǎng)液饑餓 24h后,加入 TGF-β1(15ng/ml)預處理細胞48h后再隨機分為對照組:每孔加入含 1%小牛血清的培養(yǎng)液 200 μ l,CTGF刺激組(100ng/ml):每孔加入含CTGF(100ng/ml)的 1%小牛血清培養(yǎng)液 200 μ l,PD98059+CTGF刺激組:(50 μM PD98059預處理 30 min后再加入含 CTGF(100ng/ml)的 1%小牛血清培養(yǎng)液 200 μ l),單獨 PD98059刺激組:每孔加入含 50 μ M PD98059的 1%小牛血清培養(yǎng)液 200 μ l。各組均刺激48h后每孔加入 5mg/mlMT T各 20 μ l,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h后,加入 DMSO室溫震蕩 20min后,在 Bio Tek酶標儀 490nm處測定每孔的吸光度值。每組各設 4個復孔及 2個空白孔。

2.3 Western蛋白印跡法測定 p-ERK-1/2,ERK-1/2蛋白水平 TGF-β1(15ng/ml)預處理細胞48h后,再用 100ng/ml CTGF刺激細胞,分別于0min、15min、30min、60 min四個時間點檢測 p-ERK-1/2、ERK-1/2表達。用細胞裂解液裂解細胞,等量取40μ l蛋白以 10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)移蛋白至 PVDF膜上,5% 無脂奶粉室溫封閉 1h,分別與抗 p-ERK-1/2抗體(1∶1000)、ERK-1/2抗體(1∶1000)4℃孵育雜交過夜,ECL顯色,X膠片曝光。TYPHOON掃描儀成像,采用 Imagequant TL軟件分析蛋白條帶,以 p-ERK-1/2與 ERK-1/2比值判斷結(jié)果。實驗重復 3次。

3 統(tǒng)計學處理 本組采用 SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以表示,采用單因素方差分析,以 P＜0.05為有顯著性差異,P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 Western蛋白免疫印跡檢測α-SMA蛋白表達見圖 1～ 2。 TGF-β1預處理細胞后對照組有α-SMA蛋白表達,CTGF刺激組細胞內(nèi)α-SM A蛋白水平明顯高于對照組(P＜0.01),PD98059+CTGF刺激組的α-SMA蛋白表達明顯低于 CT GF刺激組(P＜0.05),而單獨 PD98059刺激組與對照組相比α-SMA水平也無明顯變化(P＞ 0.05),說明 PD98059本身對α-SMA表達無影響。

2 M TT法檢測細胞增殖 見附表。CTGF刺激組細胞增殖明顯與對照組相比(P＜0.01),PD98059+CTGF刺激組與 CTGF刺激組相比增殖明顯下降(P＜0.05),而單獨 PD98059刺激組與對照組相比細胞增殖無明顯變化(P＞ 0.05),說明 PD98059本身對細胞增殖無影響。

3 Western蛋白印跡法測定 P-ERK-1/2,ERK-1/2蛋白水平 見圖 3。CTGF刺激細胞 15min時能明顯誘導細胞內(nèi) ERK-1/2磷酸化與 0min相比(P＜0.01)30min時達到高峰,60min時下降到基礎水平。

圖1 α-SM A蛋白在各組中相對光密度表達 1示對照組;2示 CTGF組;3示 PD98059+CTGF組;4示 PD98059刺激組

圖2 CTGF刺激 TGF-β1預處理的細胞對細胞內(nèi)α-SM A表達的影響及 PD98059對其阻斷作用

圖3 p-ERK,ERK相對光密度表達

附表 各組細胞增殖增殖情況(±s)

附表 各組細胞增殖增殖情況(±s)

注:*與對照組比較,P＜0.01;#與 CTGF組比較,P＜0.05

組 別 吸光度值對照組 0.272±0.021 CTGF刺激組 0.402± 0.030*PD98059+ CTGF刺激組 0.288± 0.023#PD98059刺激組 0.276± 0.026

討 論

肺纖維化的主要病理特征是間質(zhì)成纖維細胞,肌纖維母細胞大量增殖及細胞外基質(zhì)大量聚積,其中肌纖維母細胞是產(chǎn)生和分泌細胞外基質(zhì)的主要效應細胞。另一方面肌纖維母細胞在纖維化部位持續(xù)存在還有利于異常的肺泡上皮重建,體外研究[3]表明,IPF中的肌纖維母細胞分泌血管緊張素肽,它能誘導鄰近肺泡上皮細胞凋亡。此外,IPF中的肌纖維母細胞還具有其他表型特征,如提高自身的遷移能力,增加自身的收縮性[4]。因此,肌纖維母細胞的存在如否和數(shù)量多少被認為是預測慢性纖維化疾病預后的良好指標。在肺組織纖維化慢性進展過程中,肌纖維母細胞的來源既由組織局部成纖維細胞和肺泡上皮上皮細胞在各種炎癥因子刺激下不斷轉(zhuǎn)化而來,也可來源于肌纖維母細胞的增殖。胡永斌等[2]實驗已經(jīng)證明 TGF-β1能夠誘導成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細胞。本實驗在 TGF-β1誘導下,成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細胞后,再以 CTGF刺激可以使α-SM A水平增加,M TT法進一步證實CTGF是通過促進這種轉(zhuǎn)化的肌纖維母細胞增殖而上調(diào)α-SMA蛋白。提示 CTGF和 T GF-β1在促進肌纖維母細胞生成的作用環(huán)節(jié)不同,即 TGF-β1誘導成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化生成肌纖維母細胞,CTGF促進肌纖維母細胞增殖。本研究顯示 CTGF可促進細胞外基質(zhì)的主要來源細胞—肌纖維母細胞增殖,說明 CTGF在肺纖維化疾病的發(fā)病環(huán)節(jié)中起重要作用。CT GF促肌纖維母細胞增殖的分子機制是值得我們深入了解的問題。絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)轉(zhuǎn)導途徑是細胞增殖與分化信號傳導的共同通路,是成纖維細胞等許多細胞中多種信號向核內(nèi)傳遞的共同途徑。其中 ERK1/2及其磷酸化連鎖反應在有絲分裂細胞分化的過程中非常關鍵,是細胞轉(zhuǎn)型和增殖的關鍵酶。ERK1/2活化是很多細胞通過 G1限制點進入 S期所必須的。我們通過觀察 CTGF對肌纖維母細胞內(nèi) ERK-1/2信號途徑的影響發(fā)現(xiàn) CTGF可以明顯活化 ERK-1/2;并且用ERK-1/2活化特異阻斷劑 PD98059可以明顯阻斷CTGF引起的細胞增殖和α-SM A增加。說明 CTGF促肌纖維母細胞增殖效應是通過 ERK-1/2信號途徑介導的,這與 Yosimichi等[5]的 CTGF通過 Erk-1/2信號通路促進軟骨細胞增殖的報道一致。說明阻斷CTGF的信號通路可以有效抑制 CTGF促肌纖維母細胞增殖效應。本研究探討了 CTGF促進 TGF-β1誘導活化的肌纖維母細胞增殖作用及其分子機制,為CTGF成為干預肺纖維化的藥物靶標提供了理論基礎。

[1] Badid C,Vincent M,Fouque D,et al.Myofibroblast:a prognosticmarker and target cell in progressive renal disease.Ren Fail,2001,23:543-549.

[2] 胡永斌,初 令,李 翔,等.轉(zhuǎn)化生長因子β1對人胚肺成纖維細胞平滑肌 肌動蛋白表達的影響.中華結(jié)核和呼吸雜志,2004,27(7):488-490.

[3] Selman M,Thannickal V J,Pardo A,et al.Idiopathic pulmonary fibrosis.Drugs,2004,64(4):405-430.

[4] Miki H,Mio T,Nagai S,et al.Fibroblast contractility:usual interstitial pneumonia and nonspecific interstitial pneumonia.Am J Respir Crit Care Med,2000,162(6):2259-2264.

[5] Yosimichi G,Nakanishi T,Nishida T,et al.CTGF/HCS24induces chondrocyte differentiation through p38 mitogen-activated protein kinas( p38M APK),and proliferation through ap44/42M APK/extracellularsignal regulated kinase(ERK).Eur JBiochem,2001,268(23):6058-6065.