陜西省寶雞市華山醫(yī)院(寶雞 721000) 王廣生 張開放 姚永峰 李 政 閆宏偉

兒童股骨頭軟骨炎,亦稱為 Legg-Perthes病,兒童股骨頭缺血壞死病等,發(fā)生于兒童股骨頭。Perthes病一般在 4～ 9歲發(fā)病,常遺留不同程度的畸形和關(guān)節(jié)功能障礙并發(fā)展為早期骨性關(guān)節(jié)炎,嚴(yán)重危害兒童的身心健康[1,2]。盡管多年來國內(nèi)外學(xué)者對該病進(jìn)行了大量研究,發(fā)病機(jī)制仍不明確。因此,本組通過建立兔Perthes病模型觀察股骨頭骺軟骨 II型膠原及其血清抗體的變化以探討 Perthes病的發(fā)病機(jī)制。

材料與方法

1 動(dòng)物與分組 選用經(jīng) X線拍片證實(shí)雙側(cè)股骨頭骺板完整無損且未閉合骨化的健康新西蘭長耳白兔(1月齡)30只,雌雄各半。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)抽取 10只為對照組,其余為實(shí)驗(yàn)組。動(dòng)物由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 動(dòng)物模型建立 所有動(dòng)物經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng) 2周后開始造模,具體步驟:①新西蘭長耳白兔 2.5%硫噴妥鈉 1.0～ 1.5ml/kg ip全麻后,仰臥位且髖半屈位固定。②驅(qū)血帶驅(qū)血后在 X線監(jiān)控下應(yīng)用 12號骨穿刺套針經(jīng)皮穿入右側(cè)股骨頸中央達(dá)骺板遠(yuǎn)側(cè),向股骨頸內(nèi)注入醫(yī)用 T H膠 0.5ml,對照組注入生理鹽水 0.5 ml。③術(shù)后給予青霉素 80萬 U肌注 3d預(yù)防感染。④在術(shù)后第 4、6、8、10、12周時(shí)分別行 X線檢查,6周出現(xiàn)股骨頭骨骺高度下降,關(guān)節(jié)間隙輕度增寬,關(guān)節(jié)周圍軟組織輕度腫脹,骨密度改變表示造模成功。⑤將飼料盆及飲水盆均置于高處,使動(dòng)物進(jìn)食及飲水時(shí)雙后腿負(fù)重。

3 實(shí)驗(yàn)取材 實(shí)驗(yàn)取材方法如下[3]:①在術(shù)后第4、6、8、 10、12周處理動(dòng)物。②先后肌注氯胺酮(10mg/kg)及安定 (0.5mg/kg)進(jìn)行麻醉,麻醉起效后,拍 X線片,并抽取靜脈血液注入抗凝管,立即進(jìn)行離心處理。③處死動(dòng)物后,立刻收集股骨頭標(biāo)本,進(jìn)行 10%福爾馬林溶液固定。

4 實(shí)驗(yàn)觀察

4.1 一般觀察 觀察并記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重、飲食、精神狀態(tài)、活動(dòng)及死亡情況。

4.2 病理學(xué)觀察 通過固定、脫鈣沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色制作股骨頭病理切片。在光學(xué)顯微鏡下觀察頭下區(qū),任選高倍鏡下 10個(gè)視野,每個(gè)視野內(nèi)計(jì)數(shù) 50個(gè)骨陷窩,求出空骨陷窩數(shù)的百分比,取平均值。

4.3 免疫組化 取標(biāo)本經(jīng)固定、包埋、切片、脫蠟入水。3%過氧化氫溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗滌,蛋白酶消化,山羊血清封閉,抗兔Ⅱ型膠原抗體反應(yīng),37℃孵育,PBS反復(fù)洗滌后,DAB顯色。蘇木素復(fù)染、脫水、封片。顯微鏡下觀察。

4.4 血清Ⅱ型膠原抗體測定抗Ⅱ型膠原抗體加入酶標(biāo)板,進(jìn)行包被,4℃過夜。待測血清加入酶標(biāo)板,同時(shí)設(shè)三孔平行對照(陽性對照、陰性對照及空白對照)。置于 37℃孵育 2 h,洗液洗板后加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗,37℃孵育 1 h,洗滌后加底物溶液 DAB顯色,加 2 mol/L硫酸終止反應(yīng),在 450 nm處檢測吸光度值。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本組數(shù)據(jù)均采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),以P＜0.05為有顯著性差異,P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 一般觀察 ①對照組兔毛發(fā)光澤,活動(dòng)靈活,反應(yīng)靈敏,食欲正常,飲水量變化不大,體重逐漸上升,術(shù)后右下肢出現(xiàn)輕度跛行,1周后恢復(fù)正?；顒?dòng)。實(shí)驗(yàn)組兔一般情況較對照組稍差,術(shù)后立刻出現(xiàn)右下肢輕度跛行,1周左右恢復(fù)正常活動(dòng),第 6周再次出現(xiàn)跛行并逐漸加重。②動(dòng)物存活情況:對照組新西蘭兔全部存活,實(shí)驗(yàn)組因腹瀉死亡 2只。

2 病理學(xué)改變 對照組骺板較厚,骺板中的軟骨細(xì)胞活躍。軟骨下骨小梁粗大且排列整齊有序,其中可見骨細(xì)胞核呈圓形或卵圓形,多位于中央,空骨陷窩數(shù)為 6.45%,骨髓組織增生活躍,造血細(xì)胞豐富,脂肪細(xì)胞少見(見圖 1)。實(shí)驗(yàn)組在第 6周時(shí)軟骨下骨小梁稀疏,出現(xiàn)斷裂,空骨陷窩數(shù)為 14.27%,高于同期對照組(見圖 2)。第 8周時(shí)股骨頭軟骨層變薄,軟骨下骨小梁非常稀疏、斷裂甚至消失,空骨陷窩數(shù)為 23.53%,較同期對照組顯著增加(P＜0.01),髓內(nèi)造血組織減少(見圖 3)。第 12周模型組股骨頭軟骨層較薄,軟骨下骨小梁變細(xì),間距增大,結(jié)構(gòu)紊亂,斷裂更為顯著,空骨陷窩率達(dá) 41.46%,較對照組有極顯著性差異(P＜0.01),造血細(xì)胞數(shù)量減少(見圖 4)。各組動(dòng)物空骨陷窩計(jì)數(shù)比較見表 1。

圖1 對照組骨小梁排列整齊有序,骨小梁粗大 ,未見吸收或斷裂現(xiàn)象(HE×100)

圖2 實(shí)驗(yàn)組第 6周骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂、稀疏(HE×200)

圖3 第周骨小梁非常稀疏,骨小梁斷裂甚至消失(HE×200)

圖4 第 12周骨小梁變細(xì),間距增大,結(jié)構(gòu)紊亂,骨小梁斷裂消失更為顯著(HE×200)

3 免疫組化結(jié)果 注射醫(yī)用 TH膠后 4周Ⅱ型膠原開始增多。6～ 8周軟骨及骨骺Ⅱ型膠原明顯增多,結(jié)構(gòu)紊亂,排列不整齊(見圖 5)。 10周軟骨及骨骺處Ⅱ型膠原結(jié)構(gòu)紊亂,排列稀疏,較前明顯(見圖 6)。12周軟骨及骨骺處Ⅱ型膠原明顯減少,結(jié)構(gòu)紊亂程度加重(見圖 7)。

圖5 第 6周軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)(×1000)

圖6 第 10周軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)(×500)

圖7 第 12周軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)(×200)

4 血清抗Ⅱ型膠原抗體檢測結(jié)果 檢測結(jié)果見表 2。注射醫(yī)用 T H膠后 4周,Ⅱ型膠原抗體吸光度較對照組增大。6～8周時(shí)Ⅱ型膠原抗體的吸光度較 4周時(shí)增大。在第 10、12周時(shí)可見對照組的吸光度未見明顯變化,而實(shí)驗(yàn)組的吸光度隨時(shí)間不斷增大,且兩者的吸光度比值也逐漸增大。

表1 各組動(dòng)物空骨陷窩計(jì)數(shù)比較(±s)

表1 各組動(dòng)物空骨陷窩計(jì)數(shù)比較(±s)

注:與同期對照組比較,* P＜0.01

組 別 n 4周 6周 8周 10周 12周對照組 6 6.42± 0.80 6.44± 0.39 6.43± 0.60 6.44± 0.30 6.52± 0.36實(shí)驗(yàn)組 6 8.45± 1.26* 14.27± 1.04* 23.53± 2.18* 30.72± 2.27* 41.46± 3.43*

表2 各組動(dòng)物血清中抗Ⅱ型膠原抗體水平的比較(±s)

表2 各組動(dòng)物血清中抗Ⅱ型膠原抗體水平的比較(±s)

注:與同期對照組比較,* P＜0.01

組 別 4周 6周 8周 10周 12周對照組 1.084± 0.114 1.078± 0.102 1.065± 0.104 1.081± 0.110 1.076± 0.107實(shí)驗(yàn)組 2.382± 0.655* 2.412± 0.713* 2.534± 0.525* 2.772± 0.512* 2.892± 0.613*

討 論

Ⅱ型膠原是關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)的主要蛋白,分布在全層,是維持關(guān)節(jié)軟骨的主要細(xì)胞外基質(zhì),而且完整Ⅱ型膠原的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)決定軟骨的特性。當(dāng)股骨頭關(guān)節(jié)囊壓力增高而沒有及時(shí)的去除,關(guān)節(jié)持續(xù)負(fù)重使軟骨受壓膠原纖維變彎曲,嚴(yán)重時(shí)呈水平狀,部分纖維結(jié)構(gòu)紊亂。在淺表層的受壓區(qū)與非受壓區(qū)之間,較大的張力使膠原纖維出現(xiàn)斷裂,而異常高應(yīng)力會(huì)引起膠原纖維網(wǎng)的疲勞和斷裂,蛋白多糖隨之丟失,軟骨細(xì)胞暴露;同時(shí)軟骨細(xì)胞損傷又使軟骨基質(zhì)合成障礙,導(dǎo)致軟骨基質(zhì)進(jìn)一步破壞而發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎[4]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在早期Ⅱ型膠原染色比正常對照組深,尤其在軟骨細(xì)胞周圍和胞漿內(nèi)染色加深更明顯,提示其合成增加[5]。但隨著時(shí)間的延長,Ⅱ型膠原失染逐漸由切線層向深層發(fā)展,表明軟骨內(nèi)膠原破壞也由切線層向深層發(fā)展[6]。這可能是因?yàn)樵诠切躁P(guān)節(jié)炎早期,軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)金屬蛋白酶,破壞包括Ⅱ型膠原在內(nèi)的基質(zhì)成分。另外,在早期軟骨膠原破壞的量小于增加的量,到晚期Ⅱ型膠原降解的量大于合成的量,Ⅱ型膠原總量減少,軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能明顯受損。而軟骨下骨表現(xiàn)為骨小梁結(jié)構(gòu)變細(xì)、紊亂或消失,導(dǎo)致骨皮質(zhì)變薄,骨骺變薄甚至骨化。當(dāng)負(fù)重時(shí),拱橋結(jié)構(gòu)在機(jī)械壓力的作用下發(fā)生微細(xì)骨折,將引起股骨頭塌陷變形,骨內(nèi)微血管引起缺血,血黏度增加,血流受阻,無氧酵解繼而導(dǎo)致 Perthes病的發(fā)生。

當(dāng)關(guān)節(jié)損傷或關(guān)節(jié)內(nèi)血流受阻時(shí),Ⅱ型膠原會(huì)釋放入血,刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身免疫攻擊,這可能是關(guān)節(jié)軟骨炎發(fā)生機(jī)制之一[7]。Miyamoto等[8]通過實(shí)驗(yàn)用CCⅡ免疫大鼠后形成膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎證明了上述觀點(diǎn)。最近的研究發(fā)現(xiàn),Th1免疫應(yīng)答是誘導(dǎo)和導(dǎo)致此病必需的,而且 Perthes病的病理變化極其相似[9]。當(dāng)Ⅱ型膠原暴露于免疫系統(tǒng),將會(huì)刺激產(chǎn)生Ⅱ型膠原抗體,導(dǎo)致骨軟骨炎,這需要特定的 M HC分子、細(xì)胞免疫、體液免疫以及相關(guān)細(xì)胞因子等的參與。此外,破骨細(xì)胞和膠原酶的介入導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)的喪失,出現(xiàn)關(guān)節(jié)的變形和僵硬[10]?？耿蛐湍z原還通過結(jié)合關(guān)節(jié)軟骨活化補(bǔ)體系統(tǒng)對滑膜浸潤破壞。這些免疫反應(yīng)最終導(dǎo)致了Perthes病的發(fā)生。

綜上所述:①在本實(shí)驗(yàn)中先出現(xiàn)軟骨內(nèi)Ⅱ型膠原的改變,促使骺板、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞等出現(xiàn)大量變性壞死,最終導(dǎo)致 Perthes病的發(fā)生;②在模型動(dòng)物軟骨內(nèi)Ⅱ型膠原發(fā)生改變,隨后出現(xiàn)Ⅱ型膠原血清抗體變化,這是 Perthes病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。因此,對Ⅱ型膠原及其血清抗體的進(jìn)一步研究可為 Perthes病早期診治提供理論依據(jù)。

[1] Lieberman JR,Berry DJ,M ont M A,et al.Osteonecros is of the hip: management in the 21st century.Instr Course Lect,2003,52(2):337-255.

[2] 康鵬德.股骨頭壞死的研究和治療進(jìn)展.中國骨與關(guān)節(jié)損傷雜志,2005,20(1):65-68.

[3] 周 茹,楊以阜,左建平.Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的建立及影響因素.中國藥理學(xué)通報(bào),2006,22(12):1532-1535.

[4] 馮 勇,胡穎堅(jiān),鄭穎文,等.兒童股骨頭缺血壞死的SPECT顯像特點(diǎn).廣東醫(yī)學(xué),2004,25(1):68-69.

[5] Migaud H,Chantelot C,Giraud F,et al.Long-term survivorship of hip shelf arthroplasty and Chiari osteotomy in adults.Clin Orthop Relat Res,2004,418(1):81-86.

[6] 嚴(yán) 軍,董天華,潘 陽 ,等.Perthes病與易栓癥的相關(guān)性研究.江蘇醫(yī)藥,2003,29(8):605-607.

[7] Gordon JE,Schoenecker PL,Osland JD,et al.Smoking and socioeconomic status in the etiology and severity of Legg-Calve-Perthes′disease.J Pediatr Orthop B,2004,13(6):367-370.

[8] Miyamoto Y,Matsuda T.A recurrent mutation in type II collagen gene causes Legg-Calv é-Perthes disease in a Japanese family,Hum Genet,2007,121(6):625-629.

[9] Diley A,Hooper WC.The fibrinogen gene G-455-A polymorphism is a risk factor for Legg-Perthes disease.J Throm Haem,2005,23(1):2317-2321.

[10] Crofton PM,Macfarlane C,Wardhaugh B,et al.Childrenwith acutePerthes′disease have asymmetrical lower leg growth and abnormal collagen turnover.Acta Orthop,2005,76(6):841-847.