西安紅十字會醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科(西安 710054)

宋 偉 王坤正* 姚建鋒 張育民 秦四清 于振濤# 王傳文☆

*西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨一科

#西北有色金屬研究院

☆河南省商丘市第一人民醫(yī)院

隨著創(chuàng)傷骨折及關(guān)節(jié)疾病的日益增多,矯形外科技術(shù)以及生物材料工程也飛速發(fā)展,其中開發(fā)新型醫(yī)用生物材料日益重要。由西北有色金屬研究院研究開發(fā)的新型鈦合金 TLM及其復(fù)相二氧化鈦生物活性涂層材料,其用途主要是制作骨科內(nèi)固定器材、關(guān)節(jié)假體等體內(nèi)植入材料,將應(yīng)用于骨外科、口腔外科等臨床領(lǐng)域。為了評價(jià)新型材料體內(nèi)植入慢性毒性反應(yīng),本實(shí)驗(yàn)將受檢材料制備成特定形狀后植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉內(nèi),通過觀察多項(xiàng)指標(biāo)并與對照材料對比后綜合研究慢性毒性反應(yīng),為新材料的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 基材組:新型 TLM鈦合金,主要成分為鈦、鋯、錫、鉬、鈮及鉭;涂層組:帶有二氧化鈦復(fù)相涂層的新型 TLM鈦合金;對照組:Ti-6Al-4V合金。以上材料均為西北有色金屬研究院提供。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為 SD大鼠,購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證號:醫(yī)動(dòng)字08-005),均為健康、已斷乳并且未實(shí)施過其他任何實(shí)驗(yàn)的 6周齡動(dòng)物,體重要求范圍為 180～ 220g。按照隨機(jī)原則將大鼠分為基材組、涂層組及對照組。每組動(dòng)物數(shù)為 50只,雌雄各半,雌性均未孕育。按照 1992年中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布的《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)》的要求飼養(yǎng)。

3 實(shí)驗(yàn)樣品的準(zhǔn)備[1]所有實(shí)驗(yàn)樣品均均制備成光滑圓柱體(直徑=1.0mm,長度=5.0mm),采用煮沸法滅菌后 24h內(nèi)供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)植入使用。

4 植入方法及術(shù)后處理[1]將動(dòng)物以戊巴比妥鈉按 40mg/kg的劑量采用腹腔注射麻醉,將動(dòng)物固定于動(dòng)物手術(shù)臺上,消毒后將受試樣品圓柱體 1枚植入左側(cè)股部肌肉內(nèi),術(shù)中注意無菌操作,術(shù)后應(yīng)用抗生素。

5 實(shí)驗(yàn)觀察 術(shù)后每天觀察動(dòng)物切口有無紅腫滲出、有無植入樣品脫落、呼吸、活動(dòng)、排泄物性狀、進(jìn)食進(jìn)水量等情況,觀察時(shí)間為 6個(gè)月。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本組測量各動(dòng)物總增重?cái)?shù)值及肝、腎、脾及腦組織重量計(jì)算臟器指數(shù)后以 SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,以 P＜0.05為有顯著性差異,P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 一般觀察 見表 1。手術(shù)后第 1、2天,分別有對照組 3只、基材組 1只、涂層組 2只大鼠出現(xiàn)不同程度倦怠、毛發(fā)凌亂、活動(dòng)不積極,3d后癥狀自行消失。所有受試動(dòng)物均未出現(xiàn)切口紅腫等感染癥狀、樣品脫落或死亡等情況。根據(jù) ASTM有關(guān)材料生物相容性評價(jià)中動(dòng)物染毒后一般毒性觀察指標(biāo)判斷新型 TLM合金組及其二氧化鈦涂層組均屬于正常級別,未顯示出中毒表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),各組動(dòng)物均活躍健康,處死后解剖見皮膚、軟組織、淋巴結(jié)、心、肝、肺、胰、腎、腦及消化道等各主要臟器大小、形態(tài)、色澤、質(zhì)感正常,無腫瘤組織生長,材料植入部位未見囊性組織或腫瘤生長。

2 雌雄大鼠增重、肝、脾、腎腦等變量比較 見表2～4。 三組兩兩之間無顯著性差異(P＞ 0.05)。

表1 染毒后動(dòng)物毒性反應(yīng)觀察指標(biāo)及相應(yīng)分級

表2 雄性增重、肝、脾、腎、腦等變量比較 (±s,g)

表2 雄性增重、肝、脾、腎、腦等變量比較 (±s,g)

組別 增重 肝 脾 腎 腦A 87.564± 1.3967 4.0872± 5.805 0.4068± 1.588 0.7440± 1.637 0.2864± 3.553 B 87.196± 1.5654 4.0176± 8.883 0.4232± 1.606 0.76± 1.894 0.2912± 4.216 C 85.98± 1.5009 4.11± 5.848 0.4344± 1.527 0.7464± 1.888 0.2896± 3.628

表3 雌性增重、肝、脾、腎、腦等變量比較 (±s,g)

表3 雌性增重、肝、脾、腎、腦等變量比較 (±s,g)

組別 增重 肝 脾 腎 腦A 84.1± 1.3956 4.08± 5.902 0.42± 1.237 0.73± 2.063 0.29± 1.1485 B 81.5± 1.3729 4.06± 5.921 0.41± 1.617 0.76± 1.568 0.29± 4.000 C 82.4± 1.56 4.06± 5.932 0.42± 1.723 0.75± 2.230 0.29± 4.096

表4 雌雄各組增重、肝、脾、腎、腦等變量比較(±s,g)

表4 雌雄各組增重、肝、脾、腎、腦等變量比較(±s,g)

組別 增重 肝 脾 腎 腦A 85.55± 1.0213 4.08± 4.097 0.41± 1.006 0.74± 1.304 0.29± 2.5743 B 85.6± 1.0780 4.06± 5.302 0.42± 1.129 0.755± 1.218 0.29± 2.885 C 84.4± 1.0960 4.07± 4.127 0.425± 1.150 0.75± 1.446 0.29± 2.710

3 血液學(xué)指標(biāo)比較 見 5～7。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)每只大鼠取右心室血液約 2.5ml,檢查紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞記數(shù)、血紅蛋白、血細(xì)胞比容、總蛋白量、ALT、AST、尿素氮等指標(biāo)。結(jié)果顯示雄性大鼠對照組與涂層組、對照組與基材組之間在 BUN指標(biāo)上有顯著性差異(P＜0.05),對照組高于基材組與涂層組,而基材組與涂層組之間無顯著性差異(P＞0.05);其余指標(biāo)三組兩兩之間無顯著性差異(P＞0.05)。

表5 雄性各組間血液學(xué)指標(biāo)檢查結(jié)果(±s)

表5 雄性各組間血液學(xué)指標(biāo)檢查結(jié)果(±s)

組 別 WBC(× 109/L) RBC(× 1012/L) HGB(g/L) HCT A 7.084± 0.4154 8.5484± 0.1261 148.52± 1.1946 0.485± 6.033 B 6.96± 0.4907 8.97± 0.1962 151.64± 2.0896 0.5075± 9.182 C 6.396± 0.356 8.688± 0.1717 148.32± 1.4256 0.4888± 6.932

(續(xù))

表6 雌性各組間血液學(xué)指標(biāo)檢查結(jié)果(±s)

表6 雌性各組間血液學(xué)指標(biāo)檢查結(jié)果(±s)

組 別 WBC(× 109/L) RBC(× 1012/L) HGB(g/L) HCT A 6.748± 0.6334 7.6492± 0.142 4136.76± 1.8835 0.45652± 6.600 B 8.02± 0.3638 7.8612± 2.382 141.4± 0.8981 0.46252± 1.6724 C 6.716± 0.4426 7.9108± 0.1626 143.36± 2.3151 0.46752± 7.7119

(續(xù))

4 組織學(xué)觀察 各組動(dòng)物總體健康情況良好,肉眼檢查見心、肝、脾、肺、腎、胰腺、腦、子宮、睪丸、卵巢、附睪及雙側(cè)股部肌肉等各主要臟器及植入物周圍無異常病變或腫瘤生長,分別切取各臟器組織塊用 10%福爾馬林進(jìn)行固定,然后以石蠟包埋、切片、HE染色,在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察比較,結(jié)果顯示正常。

表7 雌雄各組間血液學(xué)指標(biāo)檢查結(jié)果(±s)

表7 雌雄各組間血液學(xué)指標(biāo)檢查結(jié)果(±s)

組 別 WBC(× 109/L) RBC(× 1012/L) HGB(g/L) HCT A 6.916± 0.37562 8.0988± 0.11395 142.84± 1.40244 0.47078± 4.8718 B 7.49± 0.31165 8.4156± 0.12584 146.52± 1.34232 0.48502± 5.6269 C 6.556± 0.28204 8.2994± 0.12953 145.84± 1.39133 0.47818± 5.3528

(續(xù))

討 論

隨外科技術(shù)發(fā)展需要,近 20年來金屬內(nèi)固定生物材料發(fā)展極為迅速。與美國、日本及許多歐洲發(fā)達(dá)國家相比,我國在該領(lǐng)域的發(fā)展相對較晚。本組所檢驗(yàn)的新型鈦合金 TLM為介穩(wěn)定β型鈦合金,是由我國自行研制的第 3代體內(nèi)植入用鈦合金。新材料選擇了鈦、鋯、鉬、錫、鉭及鈮等 6種無毒元素制作,相關(guān)測試證實(shí)具有較好的力學(xué)性能[2],采用微弧氧化工藝制作的復(fù)相二氧化鈦生物活性涂層明顯改善生物活性[3],適用于骨外科、口腔外科等領(lǐng)域用于制作鋼板、螺釘?shù)葍?nèi)固定器材及關(guān)節(jié)假體、牙種植體等的理想材料。

理論上來講,任何材料對生物體都是一個(gè)異物,生物體必然要對其產(chǎn)生相應(yīng)的反應(yīng),所以在應(yīng)用到臨床之前要進(jìn)行嚴(yán)格的安全性評價(jià),其中就包括進(jìn)行慢性毒性實(shí)驗(yàn)[4],以判定材料是否對機(jī)體組織健康產(chǎn)生威脅。本組以 SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,并根據(jù)染毒方式與樣品用途相適應(yīng)的原則,選用將材料制備成特定形狀后植入動(dòng)物體內(nèi)的方法作為染毒方式,使材料有機(jī)會接觸到體液并產(chǎn)生相互作用,并觀察多個(gè)指標(biāo)已增加評價(jià)的意義。

在材料植入動(dòng)物肌肉中后的早期,3組分別有數(shù)只動(dòng)物出現(xiàn)不同程度倦怠、毛發(fā)凌亂、活動(dòng)不積極等表現(xiàn),3d后癥狀自行消失,考慮表現(xiàn)異常在實(shí)驗(yàn)組間分布無特異性,所以無特殊毒理學(xué)意義。在各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)中,雄性大鼠 Ti-6Al-4V組 BUN數(shù)值大于基材和涂層兩組。考慮原因:①真實(shí)的毒性意義,對照合金毒性反應(yīng)損害雄性大鼠腎臟功能所致;②干擾因素所致,如檢測儀器有誤差等。以上差異需要在進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行證實(shí)。其余在一般毒性表現(xiàn)、大體解剖、血液學(xué)指標(biāo)及重要臟器組織學(xué)檢查中,新型鈦合金及涂層材料兩組均顯示正常,提示新材料具有體內(nèi)植入的安全性。

總之,將新型 T LM合金及具有二氧化鈦復(fù)相涂層的 TLM合金植入 SD大鼠股部肌肉后,在觀察時(shí)期內(nèi),綜合考察動(dòng)物的一般毒性表現(xiàn)、大體觀察、血液學(xué)指標(biāo)及主要臟器組織學(xué)切片等項(xiàng)目,未發(fā)現(xiàn)新材料有慢性毒性反應(yīng)的證據(jù),初步提示新材料具有體內(nèi)植入的安全性,為其進(jìn)一步評價(jià)研究及臨床應(yīng)用提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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[3] Sun JY, JangBC,Zhu XL,etal. Effectof hydrothermally treated anodic oxide films on osteoblast attachment and prolifcratiom[J].Bio-Materials,2003,24(3):347-355.

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