寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科(銀川 750004) 馬 濤 高玉華 孟盡海 張冬梅

急性肺損傷 (Acute lung injury,ALI)是臨床常見的危重病癥,發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜,病死率高達(dá) 50%～ 70%[1～3],而全身炎癥反應(yīng) (Systemic inflammatory response,SIR)是導(dǎo)致 ALI的根本原因[4,5]。機(jī)體受到嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、休克和其他致病因素間接或直接刺激后,引起 SIR,此過程涉及眾多細(xì)胞因子和炎性介質(zhì),形成復(fù)雜的炎性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。大量研究證實,以多形核中性粒細(xì)胞(Polymorpho-nuclear neutrophils,PMN)為主的炎性細(xì)胞與多種細(xì)胞因子在 ALI的發(fā)病過程中起著重要作用,如何調(diào)控炎性細(xì)胞因子的過度釋放,使細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)恢復(fù)平衡狀態(tài)已成為研究熱點。

高滲氯化鈉羥乙基淀粉 40注射液作為新型的羥乙基淀粉,因其取代級低、C2/C6比率高且含有 4.2%的氯化鈉及 7.6% 的羥乙基淀粉,已較廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷或失血性休克復(fù)蘇中。由于 HSH40在休克治療中表現(xiàn)出的特性與 ALI/ARDS相符,故本研究通過復(fù)制大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷模型,將 HSH40用于 ALI的早期液體治療,觀察血氣、肺濕 /干重(W/D)比值和肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性,各時相血清中 TNF-α表達(dá)的變化及肺組織的病理改變,探討 HSH40對內(nèi)毒素性急性肺損傷保護(hù)作用及可能機(jī)制。

材料與方法

1 實驗動物 健康成年雄性 SD大鼠 54只,體重 250～ 300g,由寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。實驗前分籠飼養(yǎng) 1周,自由攝取食水。實驗前禁食 12h,禁水 2h。

2 藥物與試劑 LPS(E coli O55∶B5)采購于美國 Sigma公司,HSH40由上海長征富民金山制藥有限公司提供(批號:H20041554),MPO測試盒購自南京建成生物工程研究所,TNF-αELISA試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

3 動物模型與分組 將 54只大鼠隨機(jī)分為 3組,每組 18只:空白對照組(C組 )、急性肺損傷組 (L組)和 HSH40組 (H組),每組根據(jù)時間點分為 3個亞組(亞組 n=6),即 LPS致傷后 0.5h、2h和 4h。各組動物用 3%的戊巴比妥鈉 30mg/kg腹腔注射麻醉,L組、H組經(jīng)股靜脈注入 LPS 5 mg/kg致傷,復(fù)制急性肺損傷模型[6],C組經(jīng)股靜脈注入等體積的 0.9%NS。致傷1min后 L組從股靜脈持續(xù)輸注 0.9%生理鹽水(0.9%NS)5 ml/kg,H組持續(xù)輸注 HSH405ml/kg;C組用等量 0.9%NS作空白對照,10min輸完[7]。

4 觀察指標(biāo)

4.1 血氣分析 于致傷后 4h經(jīng)股動脈采集動脈血 0.5ml,即刻在 i? STAT便攜式手持血液分析儀上測定 pH、PO2、PCO2值,記錄血氣分析結(jié)果。

4.2 肺 W/D測定 取出右肺下葉,濾紙吸干表面水分,置于干燥稱量紙上稱得濕重(W);置 65℃恒溫箱,烘烤 48h至恒重后稱量干重(D),并計算 W/D。

4.3 測定肺組織 M PO活性 右肺剩余組織在冷生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,精確稱重后,按重量體積比 1∶19加入 0.86%的冷生理鹽水冰浴中制備 5%組織勻漿(勻漿時間 10s/次,間隙 30s,連續(xù) 3次)。按照試劑盒說明書步驟,在 460nm處通過比色法測定 MPO活性(單位:活力單位,U/g組織濕片)。

4.4 血清中 TNF-α的測定 分別在大鼠致傷后0.5h、2h和 4h時間點,經(jīng)右側(cè)股動脈采血 2ml,室溫下靜置 20min,離心 (4℃,3000r/min,10min)取上清,裝入無菌 EP管后,置-80℃低溫冰箱中保存。標(biāo)本收集完整后,采用 ELISA法按照試劑盒說明書步驟,應(yīng)用全自動酶標(biāo)定量測定儀進(jìn)行檢測,根據(jù)樣品的吸光度(OD值)可在繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

4.5 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察及 ALI病理評分4h組動物處死后,取右肺組織(1cm×1cm×0.5cm)放入 10%中性甲醛溶液固定 48h,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片 (5 μ m)、脫蠟、脫水、蘇木素伊紅(Hematoxylineosin,HE)染色、脫水、封片后光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)變化。按照 Mikawa等[8]的方法從四項指標(biāo)進(jìn)行肺損傷評分:①肺泡充血;②出血;③間隙或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤或聚集;④肺泡間隔增厚或透明膜形成,根據(jù)每項指標(biāo)病變輕重進(jìn)行 0～ 4分半定量分析(0:無或極輕微損傷;1:輕度損傷;2:中度損傷;3:重度損傷;4:極重度損傷),累加各項評分的總分作為 ALI的病理評分。用 Olympus BX-51顯微鏡對病理切片攝片。

5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組內(nèi)各時間點比較采用單因素方差分析,同一時間點組間比較采用配對t檢驗,以 P＜0.05為有顯著性差異,P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 動脈血氣分析 見表 1。LPS致傷后,大鼠出現(xiàn)低氧血癥,呼吸性堿中毒。H組較 C組無顯著性差異(P＞ 0.05),H組和 C組 pH、PO2明顯高于 L組(P＜0.01),而 PCO2明顯低于 L組 (P＜0.01)。 H組的PO2、PCO2及 pH值較 L組有明顯改善(P＜0.01)。

2 肺 W/D、M PO活性及肺損傷病理評分 見表2。 L組肺 W/D、M PO活性及肺損傷病理評分顯著高于 C組(P＜0.01),H組上述各項指標(biāo)均明顯下降,與L組相比有顯著性差異(P＜0.01)。

表1 各組大鼠動脈血氣的變化 (±s)

表1 各組大鼠動脈血氣的變化 (±s)

注:*與 C組比較,P＜0.01;#與 L組比較,P＜0.01

組 別 n pH PO2(mmHg) PCO2(mmHg)C 組 18 7.39± 0.02 91.6± 2.41 34.68± 2.42 L 組 18 7.28± 0.02* 56.3± 4.73* 45.66± 1.02*H組 18 7.38± 0.03# 88.7± 2.26# 34.84± 2.66#

表2 肺 MPO、W/D及病理評分結(jié)果 (±s)

表2 肺 MPO、W/D及病理評分結(jié)果 (±s)

注:*與 C組比較,P＜0.01;#與 L組比較,P＜0.01

組 別 n 肺 W/D M PO活性(U/g組織)肺損傷評分C組 18 4.27± 0.11 3.29± 0.15 0.40± 0.51 L組 18 5.56± 0.28* 7.11± 0.16* 9.50± 1.71*H組 18 4.80± 0.19*# 5.44± 0.12*# 3.80± 0.78*#

3 血清 TNF-α的變化 見表 3。 C組 TNF-α的含量在 3個時間點均無顯著性差異(P＞0.05);L組 3個時間點兩兩間均有顯著性差異(P＜0.01),0.5h表達(dá)開始升高,2h達(dá)峰值,以后逐漸下降;而 H組 TNF-α的含量與 L組相比明顯降低,但仍高于 C組(P＜0.01),H組內(nèi) 0.5h～ 2h和 2h～4h有顯著性差異(P＜0.01),0.5h～ 4h無顯著性差異 (P＞ 0.05)。

表3 各亞組大鼠血清中 TNF-α含量的變化(±s,pg/ml)

表3 各亞組大鼠血清中 TNF-α含量的變化(±s,pg/ml)

注:組內(nèi)比較:*與 0.5h比較,P＜0.01;#與 2h比較,P＜0.01;組間同一時間點比較:▲與 C組比較,P＜0.01;★與 H組比較,P＜0.01

C組 6 49.23± 2.69 49.26± 2.55 47.61± 2.12 L組 6 201.90± 9.05▲ 346.02± 13.25★*180.83± 11.32▲*#H組 6 158.69± 7.91▲★259.85± 17.99▲★*158.54± 5.28▲★#

4 肺組織病理形態(tài)學(xué)變化 見圖 1～ 3。光鏡下,C組肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡腔完整,壁光滑,肺泡間隔均勻一致,可見少量白細(xì)胞,肺泡腔中無滲出液或滲出的白細(xì)胞;L組肺泡隔明顯增寬,肺泡壁完整結(jié)構(gòu)破壞,肺泡壁斷裂,部分肺泡內(nèi)見出血及微血栓形成,大量白細(xì)胞滲出、聚集,肺泡腔中可見滲出液、紅細(xì)胞、多形核中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,部分肺泡腔萎陷不張 ;H組肺泡壁有輕度水腫,肺間隔略有增厚,但出血和炎性細(xì)胞浸潤情況較 L組明顯減輕,肺組織結(jié)構(gòu)基本完整。

圖1 C組肺組織形態(tài)學(xué)改變(HE×100)

圖2 L組肺組織形態(tài)學(xué)改變(HE×100)

圖3 H組肺組織形態(tài)學(xué)改變(HE×100)

討 論

革蘭陰性桿菌是臨床上引起感染的常見微生物,其主要致病物質(zhì)是內(nèi)毒素(ET),而 LPS是 ET的主要成分,參與構(gòu)成革蘭陰性菌的細(xì)胞壁,是強(qiáng)誘導(dǎo)劑。LPS趨化、激活中性粒細(xì)胞(PMN)在肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)大量聚集、釋放炎性細(xì)胞因子、氧自由基等,損傷肺泡-毛細(xì)血管膜,使之通透性升高,形成了肺損傷的基本病理改變,與 ALI的發(fā)生密切相關(guān)[9,10]。本實驗?zāi)Ｐ徒M(L組)在注射 LPS 4h后,PO2、pH明顯下降,PCO2升高,肺 W/D顯著增加,肺臟出現(xiàn)了 ALI的病理學(xué)改變,肺損傷評分(9.50±1.71分 )明顯升高,說明模型復(fù)制成功。

TNF-a是創(chuàng)傷或感染后機(jī)體最早產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子之一,主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。Ayata等[11]的研究表明 TNF-a可能是炎性介質(zhì)鏈鎖反應(yīng)中最早的啟動因子,對肺有強(qiáng)烈毒性可以通過多種機(jī)制引起肺損傷。它可以促使 PMN趨化、聚集、黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞并脫顆粒釋放溶酶體,產(chǎn)生氧自由基等,還能促使單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的分化,并使巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放 IL-1、IL-6等其他細(xì)胞因子而形成級聯(lián)反應(yīng)。

本實驗結(jié)果顯示大鼠血清中 TNF-a于注射 LPS后 0.5h開始升高,2h達(dá)峰值,以后逐漸降低,經(jīng)過HSH40治療后,TNF-a含量明顯下降,以 2h最為顯著。表明在 ALI早期,TNF-a的合成和分泌亢進(jìn),這種變化導(dǎo)致致炎 /抗炎失衡,通過下列途徑引起 ALI的發(fā)生[12,13]:①增加肺血管通透性,引起肺水腫、低血壓;②上調(diào) PMN、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞對補(bǔ)體片段 CR3以及細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)、P選擇素等黏附分子的表達(dá),促進(jìn) PMN與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及遷移;③延遲 PMN凋亡,增加 PMN的細(xì)胞毒性及內(nèi)皮細(xì)胞對 PMN介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)的敏感性。而 HSH40在 ALI早期可以抑制TNF-α的合成與表達(dá),使細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)恢復(fù)平衡狀態(tài),從而減輕肺損傷的發(fā)生,發(fā)揮肺臟保護(hù)作用。

MPO是存在于 PMN嗜天青顆粒中特有的酶 ,心臟、腎和皮膚等疾病的研究證實,M PO活性是評價PMN在組織中扣押浸潤程度的可靠指標(biāo)[14]。實驗顯示,MPO活性在 C組無明顯改變,L組在 4h顯著升高,而 H組雖高于 C組,但明顯低于 L組。說明 HSH40可以抑制 PMN的呼吸爆發(fā),減輕氧自由基等活性物質(zhì)對肺的損傷。

HSH40是高滲晶體 /膠體混合液,具有比生理鹽水或其他等滲輸液高 4～ 5倍的滲透壓濃度(滲透壓為1400mOsm/L)。通過高滲氯化鈉產(chǎn)生的滲透壓梯度使水分從細(xì)胞內(nèi)、組織間隙轉(zhuǎn)移至血管內(nèi),以自體輸液的形式快速主動擴(kuò)充血容量,直接改善微循環(huán);羥乙基淀粉則可以增加膠體滲透壓,穩(wěn)定和維持有效循環(huán)血容量,從而減輕 ALI時的毛細(xì)血管滲漏和肺水腫。目前認(rèn)為高滲晶 /膠液對肺損傷的影響和可能機(jī)制有以下幾個方可面:①抑制炎性細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo);②減少中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)的扣押和減輕菌群移位,減少內(nèi)毒素血癥的發(fā)生,消除由此介導(dǎo)的 PMN呼吸爆發(fā);③打破致炎效應(yīng)和抗炎效應(yīng)之間的平衡,上調(diào)抗炎效應(yīng);④減少細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)。

綜上所述,在內(nèi)毒素性 ALI時,炎性因子 TNF-a在肺組織中大量產(chǎn)生和表達(dá),PMN黏附、聚集、扣押,肺微血管通透性增高,產(chǎn)生過度炎癥反應(yīng)。 HSH40通過阻斷 TNF-a的合成與釋放,降低肺微血管通透性,減少白細(xì)胞浸潤和減輕炎癥反應(yīng),從而對 ALI產(chǎn)生保護(hù)作用。

[1] Stapleton RD,Wang BM,Hudson LD,et al.Causes and timing of death in patients with ARDS[J].Chest,2005,128(2):479-481.

[2] Luh SP,Chiang CH.Acute lung injury/acute respiratory distress syndrome(ALI/ARDS):the mechanism,present strategies and future perspectives of therapies[J].Zhejiang Univ Sci B,2007,8(1):60-69.

[3] 邱海波.規(guī)范和提高我國急性呼吸窘迫綜合征的診斷和治療 [J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2006,18(12):705.

[4] 錢桂生.急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征研究現(xiàn)狀與展望.解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2003,28(2):97.

[5] Bhatia M,Moochhala S.Roleof inflammatory mediators in the pathophysiologyofacuterespiratorydistress syndrome.J Pathol,2004,202(2):145.

[6] YamasawaH,Ishii Y,Kitamura S.Cytokine-induced neutrophil chemoattractant in a rat model of lipopolysaccharide-induced acute lung injury.Inflammation,1999,23(3):263-274.

[7] Russell DH,Barreto JC,Klemm K,et al.Hemorrhagic shock increases gut macromolecular permeability in the rat[J].Shock,1995,4(1):50.

[8] Mikawa K,Nishina K,Takao Y,et al.ONO-1714,a nitric oxide synthase inhibitor,attenuates endotoxin-induced acute lung in rabbits.Anestth Analg,2003,97(6):1751-1755.

[9] Ulitck T,Watson Y,Songmei K,et al.The intratrachcal dministration of lipopolysacchharide and cytokines:characterization of LPS-induced IL-1,and TN F-inflammatory infiltrate.Am J Pathol,1991,138(6):1485-1496.

[10] Jorg R,Klaus L.Bench-to-bedside review:acute respiratory distress syndrome-how neutrophils migrate into the lung.Crit Care,2004,8(6):453-461.

[11] Ayata A.Perrin MM,M eldnum DR,et al.Hemorrhage induced an increase in serum TNF which is not associated with elevated levels of endotoxin.Cytokine,1990,16(2):170.

[12] Goodman RB,Pugin J,Lee JS,et al.Cytokine-mediated inflammation in acute lung injury[J].Cytokine Growth Factor Rev,2003,14(6):523-535.

[13] Shimabukuro DW,Sawa T,Gropper M A.Injury and repair in lung and Airways[J].Crit Care Med,2003,31(Supp1):524-531.

[14] Rizoli SB,Rotstein OD,Parodo J,et al.Hypertonic inhibition of exocytosis inneutrophils:central role for osmotic actin skeleton remodeling.Am J Physiol Cell Physiol,2000,279(3):619-633.